饲料中多种呕吐毒素（DON，3-DON，15-DON）检测方案(液相色谱仪)

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表2.DON， 3-DON， 15-D0N标准曲线方程 曾明飞 金燕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 采用液相色谱仪紫外检测器分离分测饲料中多种呕吐毒素(DON， 3-DON，15-DON)，其3-DON， 15-DON 为同分异构体，能够方便快速地检测饲料中的多种呕吐毒素，具有灵敏度高、重现性好等优点。 引言 呕吐毒素 (Vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，化学名为3α，7α，15一三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，属单端孢霉烯族化合物。由于它可以引起猪的呕吐而得名“2.对人体有一定危害作用，欧盟分类标准为三级致癌物。欧盟要求呕吐毒素要小于1.0mg/kg；中国饲料要求低于1ppm 134。 DON 的污染常出现于小麦、大麦、玉米和饲料中，因此绝大部分 DON 检测方法是针对这些物质，而分析谷物及饲料中的 DON 并非易事，许多因素必须给以良好控制。日常检测的3种毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15-脱氧雪腐镰刀菌烯醇。例如要从大量的原始材料中抽取适当的样品，适当地储备、处理以及恰当地从样品中抽小样。原始材料可能存在的不均一性和在储备、分装过程中可能出现的污染物使分析进一步复杂化；另一方面，分析过程中需要估计精确度、精密性、最低检出限以确保检测得出的数据能具有代表 性，尽可能把分析错误减到最小。目前呕吐毒素的分析测定一般采用薄层色谱法(TLC)、酶联吸附免疫法(ELISA) 和高效液相色谱法(HPLC)。 图1.呕吐毒素结构式 其中 TLC 法繁琐费时，且灵敏度、特异性较差，提取过程中所需有机溶剂品种多且量大，易污染环境，对人体有较大危害。而 ELISA 法测定结果受试剂盒差异、实验温度、仪器灵敏度等条件影响较大，重复性差，假阳性率高，难以达到相关技术要求。HPLC法检测灵敏度高、重复性好、操作简便、快速灵敏，目前已作为粮谷中呕吐毒素的最常用测定方法。 ( 仪器 ) 高压二元液相色谱仪 (Thermo Scientific Dionex Ultimate HPG-3400SD系列，配置4通道真空脱气机 SRD3400， 双梯度快速分析型色谱泵 HPG 3400 SD， 自动进样器 WPS-3000SL，柱温箱TCC-3000SD，二极管阵列检测器 DAD-3000SD，Chromeleon Chromatography Data System 7.2。 试剂和对照品 ( 乙腈(Optima 级， Fis h er Chemical， P / N A955-4， LOT138549)甲醇(HP L C 级， Fisher Chemical， P / N A454-4， L O T 135154) ) 去离子水，18.2MQ-cm (Thermo Scientific GenPure Pro UV-TOC，P/N 50131948) 磷酸(Fisher Chemical，ACR#201145000，LOT A0313947) DON， 3-DON， 15-D0N标准品99.99%，购自Sigma-Aldrich。 标准品溶液制备 DON， 3-DON，15-DON 标准曲线：移取 DON， 3-DON，15-DON 标准溶液，用去离子水逐级稀释，0.05，0.25，0.5，1，2.5，5.0 pg/mL (3-DON&15-DON)， 0.01，0.05，0.1，0.2， 0.5，1.0 pg/mL(DON)的系列混合标准溶液。 样品溶液制备 选取市售的3种饲料做为样品，参考称取样品1g， 于10mL离心管中，加水5mL 振荡 10 min， 超声提取20 min， 以12 000 r/min 离心 15min， 取上清液过0.45 um 滤膜过滤，取0.5 mL 与 0.5 mL乙醇混合，置于4℃冰箱30 min， 氮气吹干，2mL水复溶。1mL甲醇活化SPE 柱，上样2mL，1 mL水洗脱，空气流干 10 min，1mL乙酸乙酯洗脱，氮气吹干，1mL水复溶，过 0.45 um 滤膜过滤供测定。 色谱条件 色谱分离条件： Syncronis (250 ×4.6 mm， 5 pm) (P/N 97105-254630，S/N10043724) Mobile Phase A： 1 mM 磷酸水，Mobile Phase B： ACN； 柱温：30℃，进样量：20pL， UV 检测波长：224 nm 表 1. DGLC-MS/MS 泵梯度洗脱及阀切换程序 时间(min) 流速(mL/min) Mobile Phase A A% Mobile Phase B B% 0 0.7 92.5 7.5 6.0 0.7 90 10 18.0 0.7 60 40 22.0 0.7 60 40 25.0 0.7 92.5 7.5 35.0 0.7 92.5 7.5 结果与讨论 标准品及样品色谱图 图2.DON， 3-D0N， 15-D0N标准溶液 UV色谱图 Time [min] 图3.样品加标色谱图 图4.样品色谱图 线性、检出限及 RSD 由低浓度至高浓度依次进样检测，以质量浓度与峰面积作标准曲线线性回归。结果表明， DON 在 0.01-1.0 pg/mL，3-DON&15-D0N 在 0.05-5.0 ug/mL 范围内显良好线性关系(R>0.999)。通过溶液逐步稀释法，测得最低定量限为 0.005pg/mL，检出限为 0.025 pg/mL。外标法定量。标准曲线如下： Ret.Time(min) Peak Name Cal.Type Coeff.ofDetermination C0 (Offset) C1(Slope) C2(Curve) 19.813 DON Lin， WithOffset 0.99981 -0.0036 0.0332 0 20.700 15-DON Lin， WithOffset 0.99992 0.0066 1.6584 0 21.193 3-DON Lin， WithOffset 0.99990 -0.0041 1.6761 0 回收率和精密度 分别配置低浓度 (DON 0.04 ug/mL， 3-DON&15-DON 0.16 ug/mL)，中浓度 (DON 0.2 pg/mL， 3-D0N&15-DON 0.8 pg/mL)，高浓度(DON 0.8 ug/mL， 3-DON&15-D0N 4.0 ug/mL)的标准品溶液，连续7针进样。添加一定浓度的标准品，精密度数据结果见表3。在样品中加入 (DON 0.6 ug， 3-DON&15-DON 3.0ug)，处理后经测量得 DON， 3-DON， 15-D0N的回收率分别为80.04%，86.72%，90.19%。 图6.连续7针精密度 表3.DON， 3-DON， 15-DON 精密度的结果 浓度范围 高浓度 RSD (%) 中浓度 低浓度 DON 1.85 1.44 1.26 3-DON 0.67 0.28 1.87 15-DON 0.30 0.15 1.15 实际样品测定 按上述方法测定了3种饲料样品中DON， 3-DON， 15-DON的残留量，结果样品均未检出 DON， 3-DON， 15-DON。 结论 本实验采用国家标准测定饲料中 DON， 3-DON， 15-DON，各项方法学数据均满足测定要求，是饲料中DON， 3-DON，15-DON测定的快捷有效的方法。 ( 参考文献 ) ( [1 ] 孟昭赫.酵米面，银耳等食品中椰酵假单菌及其毒素 的污染调查 [J].卫生研究，1993，22(2 ) ：99-101. ) ( [2] Krska R， B aumartner S， Jos e phs R. The s tate-of-the-art in the analysis o f type-A and -B trichothecene mycotoxins in cer e als [J] . Fresenius J Ana l Chem， 2001，3 7 1(3)：2 8 5-299. ) ( [3 ]G abriele E ngelhardt， Manfred Schuster， Johann Lepschy， Peter R. Wallnofer. P roduction o f m y cotoxins by Fusarium species isolated in Germany [J]. Zeitschrift fu r Lebensmittel - Untersuchung und Forschung， 1 986，182(2)：123-126. ) ( [4]张鹏.出入境粮谷中呕吐毒素检测方法的研究[J].检验 检疫科学，2003，1(3 2 )：8-10. ) ( [5 ] Yang， D ， G e ng， Z. M .， Yao， J.B . ， Zhang， X.， Zha n g， P.P. ， Ma， H.X.， Simultaneous determination of d e oxynivalenol， and 15 - and3-acetyldeoxynival e nol i n cereals b y H PLC-U V detection [J]. World Mycotoxin Journal， 2013，6(2)：117-125. ) ThermoFisherSCIENTIFIC SCIENTIFICAN_C_LC-       呕吐毒素(Vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)，化学名为3α, 7α, 15 一三羟基草镰孢菌-9- 烯-8- 酮，属单端孢霉烯族化合物。由于它可以引起猪的呕吐而得名[1,2]。对人体有一定危害作用，欧盟分类标准为三级致癌物。欧盟要求呕吐毒素要小于1.0mg/kg；中国饲料要求低于1ppm [3,4]。DON 的污染常出现于小麦、大麦、玉米和饲料中，因此绝大部分DON 检测方法是针对这些物质，而分析谷物及饲料中的DON 并非易事，许多因素必须给以良好控制。日常检测的3 种毒素是脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇和15- 脱氧雪腐镰刀菌烯醇。例如要从大量的原始材料中抽取适当的样品，适当地储备、处理以及恰当地从样品中抽小样。原始材料可能存在的不均一性和在储备、分装过程中可能出现的污染物使分析进一步复杂化；另一方面，分析过程中需要估计精确度、精密性、最低检出限以确保检测得出的数据能具有代表性，尽可能把分析错误减到最小。目前呕吐毒素的分析测定一般采用薄层色谱法（TLC）、酶联吸附免疫法（ELISA） 和高效液相色谱法（HPLC）。