饲料中维生素A、D和E的含量检测方案(液相色谱仪)

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实际样品的分析 引言 维生素是维持机体正常活动必不可少的物质，适量的各种维生素作为饲料添加剂能促进禽畜生长，增强禽畜体质，产生显著的经济效益。GBT17817-2010、17818-2010 和17812-2010采用 HPLC 法分别测定饲料中维生素A、D和E的含量，样品均需要经过皂化、乙醚萃取过程，通常Vitamin A 和 Vitamin E在样品中含量较高，受基质干扰较少，可直接进样分析；但 Vitamin D 含量较低，易受基质干扰，需要经过制备液相色谱的净化，收集含有 Vitamin D 的流出物后，再以 RP 刘 NP-LC进行分析，前处理过程极其繁琐。本实验拟采用在线二维中心切割方法，同时完成维生素ADE 的测定。 测试条件 仪器： Ultimate DGP 3600 系统，包括有带在线脱气单元的双三元梯度泵，自动进样器，柱温箱， DAD 一维分析柱： Acclaim C18， 120A，3×150mm×3pm 二维分析柱：Acclaim Polar Advantage II C18 120A 柱温：30℃ 检测波长：263nm，280nm， 325nm进样量：5pL； 流动相组成： 一维分离泵：A，甲醇；B， 水； 二维分析泵：A，甲醇；B，乙腈；C，水 一维和二维梯度分离程序见表1，表2。 系统连接见图1。 表1.一维分析泵及阀切换时间 时间 Flow 阀切换 右阀 左阀 (min ) mL/min A% B% 时间 位置 位置 0 0.5 85 15 0 1-2 1-6 1.5 0.5 85 15 17 1-10 1-6 15 0.5 100 0 17.6 1-2 1-6 30 0.5 100 0 25.0 1-2 1-2 30.2 0.5 85 15 35.0 1-2 1-6 表2.二维分析泵梯度 时间(min) A% B% C% 0 10 0 90 18.0 10 0 90 20.0 60 40 0 35.0 60 40 0 36.0 10 0 90 图1.系统连接图(Loop 环体体500pL) 精密称取饲料样品5g，于150mL锥形瓶中，加入 5g/L的维生素C乙醇溶液100mL， 再加入500g/L的氢氧化钾溶液25mL，在沸水浴回流30分钟，不时振荡，防止样品附着在瓶壁上，皂化结束分别用少量水自顶端冲洗其内部，取出锥形瓶并冷却至40℃。 每次100mL，合并萃取液，萃取液以水洗涤3~5次，至中性(pH试纸测试)，收集石油醚层，经过无水硫酸钠脱水。低温减压回收石油醚，至1~2mL 时转移至 10mL 棕色瓶中，氮气吹干，再以3~5mL甲醇使溶解并转移至10mL量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，待用。未用完溶液放入4℃冰箱保存。 图2.混合标准品谱图 (0~25min 为第一维分离谱图；25~35min 为第二维分离谱图) 图4.浓缩饲料样品分离谱图 图5.猪复合预混合饲料分离谱图(0~25min为一维分离；25~35min为二维分离) 图6.猪复合预混合饲料分离谱图(264nm， 0~25min 为一维分离；25~35min 为二维分离) 图7.猪复合饲料第一维(A)和第二维(B)分离分 VD3色谱峰 UV扫描图 图8.猪复合饲料料品在326nm(1) 和280nm(2)波长下叠加谱图 表3.农缩饲料含量测定结果(n=2) 取样量g 测得含量 mg/100g 维生素 D3 0.0825 维生素A 10.1260 5.345 维生素E 72.706 表4.猪复合饲料含量测定结果(n=2) 取样量g 测得含量 mg/100g 维生素D3 0.808 维生素A 10.0525 1.102 维生素E 812.98 可行性分析 常规方法比较，本法简便、快速，简化了样品前处理过程，本文利用双梯度液相色谱(DGLC)建立了在线二维柱切 提高样品分析效率，同时由图7可以看出，采用二维色换法同时测定饲料中脂溶性维生素 ADE 含量的方法，与 谱分离可以减少色谱峰的重叠，改善方法的专属性。 ThermoFisherSCIENTIFIC AN_C_LC-