氨基酸中种类及基本性质检测方案(液相色谱仪)

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Elite-AAA 氨基酸分析系统介绍 大连依利特分析仪器1有限公司 Dalian Elite Scientific Instruments Co.， Ltd. 1 Elite-AAA氨基酸分析系统 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，是生物、医药、卫生、农牧业、食品、饮料及饲料等行业生产和科研中必须的分析测试项目，并且随着中国加入 WTO 后国家相关行业标准的制定和完善，氨基酸的定性和定量分析必将成为企业的必备检测项目。由于氨基酸种类较多，结构接近，大部分没有紫外或荧光响应，使得氨基酸分析一直是高效液相色谱领域较难解决的问题之一。大连依利特分析仪器有限公司在完成国家“九五”科技攻关项目“高效液相色谱仪的研制与技术开发”的基础上，在国家“十五”攻关项目“专用高效液相色谱仪及配件”资助下，结合中国科学院大连化学物理研究所国家色谱分析研究中心的研究成果和本公司多年来的实际开发经验，针对国内科研与生产单位的实际需要，开发了此氨基酸分析系统。 Elite-AAA 氨基酸分析系统采用色谱工作站精确控制高精度二元梯度高效液相色谱系统，提供精确的流路和流动相组分控制，采用专用 ODS 固定相使十八种氨基酸得到了很好的分离，采用紫外检测器完成氨基酸的检测。 2Elite-AAA 氨基酸分析系统原理 反相色谱具有分离效率高、应用范围广、性能稳定等特点，是目前 HPLC中应用最为广泛的分离模式，但是由于氨基酸带电荷，在反相色谱柱上保留弱。用离子对试剂剂然能够在一定程度上增加保留，但是选择性差异小，分离比较困难；同时氨基酸的检测也是难点。目前最为常用的氨基酸分析方法是在分离之前使氨基酸与带疏水性基团的衍生试剂反应生成利于在反相柱上保留、分离的化合物，经柱分离后，通过相应的检测器定性、定量。 Elite-AAA 氨基酸分析系统采用2，4二硝基氟苯(DNFB)作为柱前衍生的衍生试剂，在碱性条件下氨基酸的α-氨基与 DNFB 反应生成具有紫外吸收的二硝基氟苯氨基酸(DNP-氨基酸)衍生物，进行分离与检测。 表1 Elite-AAA 氨基酸分析系统测定氨基酸的种类及基本性质 序号 中文名称 英文名称 简称 分子式 分子量 等电点 1. 天冬氨酸 Aspartic Asp HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH 133.10 2.77 2. 谷氨酸 Glutamic Acid Glu HOOC-(CH2)2-CH(NH2)-COOH 147.13 3.22 3. 丝氨酸 Serine Ser HO-CH2-CH(NH2)-COOH 105.09 5.68 4. 甘氨酸 Glycine Gly NH2-CH2-COOH 75.07 5.97 5. 苏氨酸 Threonine Thr CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH 119.12 5.64 6. 精氨酸 Arginine Arg HN=C(NH2)-NH-(CH2)3-CH(NH2)-COOH 174.20 11.15 7. 脯氨酸 Proline Pro NH-(CH2)3-CH-COOH 115.13 6.30 8. 丙氨酸 Alanin Ala CH3-CH(NH2)-COOH 89.09 6.00 9. 缬氨酸 Valine Val (CH3)2-CH-CH(NH2)-COOH 117.15 5.96 10. 蛋氨酸 Methionine Met CH3-S-(CH2)2-CH(NH2)-COOH 149.21 5.74 11. 胱氨酸 Cystine (Cys)2 (HS-CH2-CH(NH2)-COOH)2 12. 异亮氨 酸 Isoleucine Ile CH3-CH2-CH(CH3)-CH(NH2)-COOH 131.17 5.94 13. 亮氨酸 Leucine Leu (CH3)2-CH-CH2-CH(NH2)-COOH 131.17 5.89 14. 色氨酸 Tryptophan Trp Ph-NH-CH=C-CH2-CH(NH2)-COOH 204.23 5.89 15. 苯丙氨酸 Phenylalanine Phe Ph-CH2-CH(NH2)-COOH 165.19 5.48 16. 组氨酸 Histidine His NH-CH=N-CH=C-CH2-CH(NH2)-COOH 155.16 7.47 17. 赖氨酸 Lysine Lys H2N-(CH2)4-CH(NH2)-COOH 146.19 9.59 18. 酪氨酸 Tyrosine lyr HO-p-Ph-CH2-CH(NH2)-COOH 181.19 5.66 19. 半胱氨酸 Cysteine Cys HS-CH2-CH(NH2)-COOH 121.15 5.02 图1是采用 Elite-AAA 氨基酸分析系统得到的18种氨基酸的分离谱图，由图可见，18种氨基酸得到了较好的分离，完全满足氨基酸的定性和定量要求。 图1 18种氨基酸的分离色谱图 1.Asp天冬氨酸；2.Glu 谷氨酸；3.Ser 丝氨酸； 4.Gly甘氨酸；5.Thr 苏氨酸； 6.Arg精氨酸；7.Pro 脯氨酸；8. Ala 丙氨酸；9.Val缬氨酸；；10.Met 蛋氨酸； 11.(Cys)2胱氨酸；；12.Ile 异亮氨酸；：13.Leu 亮氨酸3；；14.Trp 色氨酸；15.Phe 苯丙氨駿；16.His 组氨酸；17.Lys赖氨酸；18.Tyr 酪氨酸。 3 Elite-AAA氨基酸分析系统特点 > DNFB 柱前衍生与梯度程序结合能够很好地分离十八种氨基酸，达到理想的分辨率； > 极好的定性和定量稳定性； > 极高的方法灵敏度； > 仪器成本低：柱前前生与 HPLC 系统常规紫外检测器检测，不需附加设备，降低了成本； > 一机多用：氨基酸该分析系统能够作为常规 HPLC 系统使用； > 运行成本低：缓冲溶液和有机溶剂作流动相，不需要特殊试剂，使得分析成本非常低； 有力的技术支持：公司的色谱仪器专家和分析化学家为用户提供技术保证。 4系统性能 4.1十八种氨基酸的分离情况 表2 18种氨基酸的分离度 名称 Asp Glu Ser Gly Thr Arg Pro Ala Val 分离度 9.52 15.88 5.27 1.67 3.69 1.73 1.97 19.84 名称 Met lle Leu Trp Phe His Cys Lys Tyr 分离度 3.88 8.68 1.49 5.24 1.05 1.17 3.06 4.21 2.84 4.2最低检测限 以 Arg(精氨酸)计算最低检测限为 8pmol。 4.3保留时间及峰面积的重现性 表3保留时间及峰面积的重现性 名称 Asp Glu Ser Gly Thr Arg Pro Ala Val 保留时间 RSD(%) 0.63 0.88 0.57 0.58 0.64 0.52 0.63 0.61 0.79 峰面积RSD(%) 0.84 0.53 0.68 1.06 2.29 0.88 1.24 0.93 0.62 名称 Met Ie Leu Trp Phe His Cys Lys lyr 保留时间RSD(%) 0.78 0.87 0.83 0.90 0.94 0.85 0.67 0.27 0.22 峰面积RSD(%) 0.71 1.52 1.30 1.04 1.70 0.99 1.13 0.86 2.66 4.4分析方法的稳定性 柱前衍生与依利特 HPLC 系统和色谱工作站控制软件结合，即使在梯度条件下也可提供高重现性的分离结果，确保氨基酸的完美分离。图2是一天之中7次进样氨基酸分析谱图的比较。 图2柱前衍生氨基酸分析方法的精密度 图3是衍生氨基酸样品放置于冰箱中，连续8天色谱分离保留时间结果的比较，由图可见各种氨基酸的保留时间的差异非常小，保留时间的相对标准偏差值小于 图3检测衍生氨基酸样品时，系统的稳定性 4.5衍生物的稳定性 图4是衍生后的氨基酸样品连续8天分析结果的色谱峰面积的重现性的结果，衍生物最少在8天中具有很好的稳定性。(注意：由于衍生物对光和温度具有一定的敏感性，衍生物最好放于棕色或深色的容器中并储存于冰箱中)。 图4几种氨基酸衍生物的稳定性 4.6定量分析 表4氨基酸样品的定量分析回归曲线： C(ug/mL)=aA(mV.min)+B 样品 B Y Asp 天冬氨酸 0.5259643 -0.1116872 0.9996 Glu 谷氨酸 0.6767741 -0.1169991 0.998 Ser 丝氨酸 0.4267238 -0.03437060 0.9999 Gly 甘氨酸 0.3123327 0.01505497 0.9999 Thr 苏氨酸 0.4726833 0.02445540 0.9999 Arg 精氨酸 0.8240880 0.03981918 0.9999 Pro 脯氨酸 0.5498355 0.05412328 0.9999 Ala 丙氨酸 0.3355884 0.02699055 0.9999 Val缬氨酸 0.4457435 0.04056277 0.9996 Met 蛋氨酸 0.5634785 0.05714540 0.9999 Ile 异亮氨酸 0.4909256 0.02613993 0.9998 Leu亮氨酸 0.4962105 0.04563745 0.9998 Trp 色氨酸 0.8620463 0.2397707 0.998 Phe 苯丙氨酸 0.6125983 0.3072800 0.998 His 组氨酸 0.7570975 0.4027156 0.996 Cys 半胱氨酸 0.6759151 0.4397725 0.998 Lys 赖氨酸 0.4438539 0.01518072 0.9999 Tyr酪氨酸 0.7740984 -0.01148196 0.997 5应用实例汇编 出峰顺序： 峰号 名称 峰号 名称 1 Asp 11 (Cys)2 2 Glu 12 Ile 3 Ser 13 Leu 4 Gly 14 Trp 5 Thr 15 Phe A-1.复方氨基酸注射液(18AA) a.加保护柱时氨基酸注射液的分析情况 b.未加保护柱时氨基酸注射液的分析情况 c.进口氨基酸注射液的分析情况 定量结果： 名称 Asp Glu Ser Gly Thr Arg Pro Ala 进口含量 73.11% 105.13% 105.20% 107.97% 121.96% 125.24% 106.97% 101.41% 国产含量 88.99% 68.10% 91.90% 91.89% 88.45% 88.06% 95.26% 91.40% 名称 Val Met Ile Leu Trp Phe His Tyr 进口含量 103.49% 101.25% 101.96% 99.70% 111.47% 107.98% 140.65% 116.71% 国产含量 83.69% 89.96% 84.66% 90.33% 81.77% 88.15% 86.04% 98.05% 014# 样 001#羊 014--样 40 124# 样 150)- 18 100 my 2 2 8 50- 3 567 910 13 0 T 20 30 40 Time(minutes) 表5饲料样品氨基酸含量定量分析结果 名称 Asp Glu Ser Gly Thr Arg Pro Ala Val 001#含量 1.58% 3.24% 0.93% 0.96% 1.10% 1.60% 0.96% 1.21% 1.19% 014#含量 4.34% 6.17% 1.76% 2.22% 1.82% 3.46% 1.75% 2.34% 2.16% 014-含量 4.08% 7.10% 1.86% 2.57% 2.12% 3.57% 2.01% 2.77% 2.80% 124#含量 2.79% 5.20% 1.54% 2.00% 1.67% 2.73% 1.64% 2.15% 2.15% 名称 Met Ile Leu Phe His Cys Lys lyr 总量 001#含量 0.88% 1.11% 1.68% 1.18% 0.82% 0.83% 2.28% 0.63% 22.18% 014#含量 2.35% 1.86% 3.12% 2.06% 1.71% 0.74% 4.58% 1.54% 44.00% 014-含量 1.21% 2.36% 3.68% 2.32% 1.73% 0.80% 5.07% 1.60% 47.65% 124#含量 3.08% 1.89% 2.92% 1.93% 1.69% 0.77% 4.02% 1.25% 39.41% A-3.羊绒水解样品 A-4.羊毛水解液样品 A-5. 酱油样品 A-6.啤酒样品 A-7.红酒样品