郁金中姜黄素类化合物检测方案(毛细管电泳仪)

智能文字提取功能测试中

第18卷第4期2006年4月化学研究与应用Chem ical Research and App licationVol 18，No 4Apr，2006 369第4期薛 玲等：郁金中姜黄素类化合物的毛细管区带电泳法测定 文章编号：1004-1656(2006)04-0368-04 郁金中姜黄素类化合物的毛细管区带电泳法测定 薛2玲'，林秀丽‘，张惠云，主沉浮” (1.山东中医药大学中药学院，山东 济南 250014；2山东大学药学院，山东 济南 250012：3.山东大学化学与化工学院，山东 济南 250100) 摘要：本文在提取中药郁金中姜黄素类化合物的基础上，利用毛细管区带电泳法对郁金中所含黄素类化合物进行了分离研究，确定了最佳分离条件：9mmol/L单-60苯基氨甲酰基B-CD (mono-6-O-phenylcarbamoyl-β-CD)，40mmol/L硼砂缓冲液，分离电压为15kV，毛细管柱温度为22℃，紫外检测波长为214nm，pH值为9.0。双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜姜素在此条件下10min内能够达到基线分离，方法快速、简便、且消耗试剂少，不污染环境。 关键词：郁金；姜黄素类化合物；高效毛细管区带电泳 郁金来源于姜科姜黄属多种植物的地下部分，作为传统药物之一，它具有来源广泛、价格低廉、作用多样化且疗效确切的优点。郁金中主要含有酚性成分和挥发油，酚性成分主要是姜黄素即双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素三种，[1]，姜黄素类化合物的提取、分离和测定对姜黄素、去甲氧基姜黄素和双去甲氧基姜黄素药理性能的研究及开发具有重要的应用价值。测定姜黄素的方法有分光光度法2、薄层色谱法3极谱催化波法41、库仑滴定法、高效液相色谱法161等。而用高效毛细管电泳法测定姜黄素类化合物的报道还很少，虽然刘保启等用高效毛细管电泳法对姜黄素类化合物进行了测定，但分离时间太长(将近 24m in)，污染环境(分离过程中要使用乙)，而且双去甲氧基姜黄素与去甲氧基姜黄素之间的分离度也不是很理想。本文通过实验研究表明，所用的分离方法快速(分离时间短，近10min)，不污染环境(分离过程中不使用已青等有机溶剂)，而且双去甲氧基姜黄素与去甲氧基姜黄素之间的分离度也很理想。 1.实验部分 1.1试剂与仪器 乙醇、石油醚，硼砂、甲醇等皆为分析纯；姜黄素类化合物对照品(上海友思生物技术有限公司，批号：041212)；郁金(山东济南)；单-6-0苯基氨甲酰基 -3- CD (mono-6-O-phenylcarbamoyl-B-CD)为本实验室自制.。β-CD(中国医药集团上海化学试剂公司)，水中重结晶二次，真空条件80°下干燥 2h；HP-B-CD(山东桓台新大精细化工有限公司)；二次蒸馏水。 ACS 2000高效毛细管电仪仪(北京彩陆科学仪器有限公司)，石英毛细管60cm X75pm(id)，有效长度50cm(河北永年光导纤维厂)；320-SpH计(梅特勒托利多仪器上海有限公司)；混合纤维素酯微孔滤膜 0.25um(上海兴亚净化器材厂)。 1.2 实验方法 配制 pH在8.0~10.0的 40mmol/L的硼砂-硼酸缓冲液；配制10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L不同浓度的硼砂缓冲液(pH=9.0)；称取一定量 CD溶解在硼砂缓冲液中作为电泳的 ( 基金项目：山东省中青年科学家科研奖励基金(03BS046) ) ( 联系人简介：主沉浮(1965-)，男，教授，研究方向为毛细管电泳。 Email： c h enfuz@ sdu edu cn ) 运行介质。 毛细管在使用之前用1mol/L的 NaOH充满放置1h，然后用H0洗 5min。两次运行之间依次用 0.5mol/L的 NaOH洗 2m in，HO洗 2m in，背景电解质洗2min。所用溶液均经0.25um纤维素酯膜过滤。采用电动进样，在10kV进样E55s，分离电压为15kV，检测波长为214mm。 1.3 姜黄素类化合物的提取 在索氏提取器中用95%乙醇从10g郁金粉中把姜黄素类化合物提取出来，得到棕红色的乙醇溶液。重复四次，所得溶液合并。用石油醚把姜黄油从棕红色的乙醇溶液萃取分离后，常压蒸馏。在烘箱中烘干得到固体。用95%乙醇溶解，定量转移到100mL容量瓶中，加95%乙醇定容，得到姜黄素类化合物的乙醇提取液。 1.4 对照品溶液的制备 精密称取姜黄素类化合物对照品适量，加适量乙醇溶解，定容至50mL容量瓶。 2 结果与讨论 21 pH值对迁移时间的影响 硼砂缓冲液的 pH由0.1mol/L的硼酸和0.1mol/L的 NaOH调整而成。实验中，选择硼砂缓冲液的 pH范围为8.0~10.0，因此范围内硼砂有较好的缓冲容量9]。实验结果表明，随着 pH的增加，迁移时间随之减少。这是因为随着 pH的增加，电渗流随之增加，迁移时间就会缩短。三种姜黄素类化合物的迁移时间如图1所示。由图可知，当pH值在8.0时，三种姜黄素类化合物不能分离；当pH值在8.5~9.0之间变化时，随着 pH的增加，三者的分离度逐渐增加，pH值在9.0时，三种姜黄素类化合物得到最大程度的分离。当pH值在9.0~10.0之间变化时，随着pH的增加，姜黄素和去甲氧基姜黄素的分离度逐渐减少，所以选择 pH值为9.0。此时三种姜黄素类化合物能很好的分离，且迁移时间适宜。 2.2 环糊精种类及浓度对分离度的影响 考察了 β-CD，HPB-CD以及 mono-6-Opheny-lcarbamoyl-B-CD在 40mmol/L硼砂缓冲液(pH=9.0)缓冲体系中对三种姜黄素类化合物的分离。 结果表明 β-CD、HP-B-CD的加入都不能使三种姜 黄素类化合物得到基线分离，而 mono-60-phenylcarbamoyl-β-CD的加入能使三种姜黄素类化合物得到很好的基线分离。 图1 pH值对迁移时间的影响 Fig 1 M igration times versus pH of the curcum ins 电泳条件；硼砂缓冲液浓度40mmo1/L。 mono-6-O-phenylcarbamoyl-B-CD浓度 9mmol/L；pH分别为：8.0，8.5，9.0，9.5，10.0；石英毛细管60cm X75pm(id)，有效长度50cm，电动进样，在10kV进样5s，分离电压15kV，温度22℃，检测波长214mm. 图2 mono-6-O-phenylcarbamoyl-B-CD浓度对分离度的影响 Fig 2 Effect of mono-6-O-phenlcarbamoyl-B-CDconcentration on the reso lution of the curcum ins 电泳条件：硼砂缓冲液浓度40mmol/L，pH9.0，mono-6-O-phenylcarbamoyl-B-CD浓度 (mmol/L)分别为0、1、3、5、7、 9.其它条件同图1. 考察了不同 mono-6-0phenylcarbamoyl-B-CD浓度对三种姜黄素类化事物之间分离度的影响，结果如图2所示。由图可以看出，分离度随着环糊精浓度的增加而增加，因此， mono-6O-phenylcarbamoyl-β-CD浓度选 9mmol/L最佳。实验过程中发现，迁移时间随着环糊精浓度的增加而增加，这可能是因为随着环糊精浓度的增加，其包结配合作用导致环糊精与姜黄素类化合物的相互作用 增加，因此迁移时间变长 2.3 硼砂浓度对分离度的影响 固定 pH9.0和9mmol/L mono-6O-phenylcarbamoyl-B-CD的浓度不变，当硼砂缓冲液浓度分别为10mmo1/L、20mmo1/L、30mmo1/L、40mmo1/L时.考察了缓冲液浓度对分离度的影响。结果表明，随着缓冲液浓度的增加，分离度有逐步增加的趋势，这与文献110]“高离子浓度的缓冲液能够提高分离度”一致。但是，高离子浓度的缓冲溶液会使溶液的离子强度增加，导致焦耳热增加，从而很容易使电流中断，为此本实验中选用的缓冲液浓度为 40mmo1/L。 经过实验条件的优化，在缓冲液浓度为40mmol/L；pH9.0和9mmol/L mono-60phenylcarbamoyl-B-CD的条件下对三种姜黄素类化合物的对照品进行了分离，最佳分离谱图如图3所示。 图3 三种姜黄素类化合物的对照品的分离谱图 Fig 3 The electropherogram s of thestandard mixture solution 电泳条件：硼砂缓冲液浓度40mmol/L，pH 9.0， mono-60-phenylcarbamoyl-β-CD浓度 9mmol/L。其它条件同图1. 2.4 方法的线性范围，稳定性及检测限 在最佳条件下，对方法的线性范围，稳定性及检测限进行了考察。双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素和姜黄素的回归方程(n=6)分别为： 线性范围分别为50ug/mL~ 1000ug/mL， 45pg/mL ~900pg/mL， 50pg/mL~ 1000pg/mL。逐级稀释对照品储备液，按 S/N=3获得的最小检测限分别为45ug/mL，38pg/mL，46pg/mL。 2.5 样品测定 在最佳实验条件下，测定了中药郁金中三种姜黄素类化合物的含量，其分离谱图如图4所示。实际样品中分析物含量的计算如表1所示。 Migration times(min) 图4中药郁金中三种姜黄素类化合物的分离谱图 Fig 4 The electropherogram s of the real sample 电泳条件：硼砂缓冲液浓度40mmol/L，pH 9.0- 0，mono-6-O-phenylcarbamoy1-B-CD浓度 9mmol/L。其它条件同图1。 表1 实际样品中分析物的含量(n=3) Table 1 Contents of three curcum insin the real sample(n=3) 样品成分 含量%RSD(%) 双去甲氧基姜黄素 0. 40 4.19 (B is-demethoxy curcumin) 去甲氧基姜黄素(Demethoxy curcu- 0.57 3.67 min) 姜黄素(Curcum in) 0.31 4.56 3 结论 本文借助于环糊精衍生物单-60苯基胺甲酰基β-CD对中药郁金中三种姜黄素类化合物进行了分离和含量测定。同时考察了单-60苯基胺基甲酰基β-CD浓度、缓冲液 pH值和浓度对三种姜 黄素类化事物毛细管电泳分离的影响。结果表明，最佳实验条件为：硼砂缓冲液浓度为 40mmol/L，pH9.0， mono-6-O-phenylcarbamoyl-B-CD的浓度为 9mmol/L；在最佳实验条件下，单60苯基氨基 ( 参考文献： ) ( [1] S oudam ini K K ， K u ttan R . C y totoxic and t u mour-reducting properties of curcum in[J]. Indian J. Pham acol 1 988，20 ( 1 )：95-101. ) ( [2] A lia S h amas N. Detem ination of c urcum in by spe c tro- photometry [J]. Indian Drugs 1990，28(1) ： 3 3-35. ) ( [3] J anssena G o le T De t emm ination of curcum in in f l avouring by TLC [J ] . Ch rom atographia. 1984， 1 8(10)：546-549. ) ( [4]程司，刘智厂，曹云新，等.姜黄素的化学测定新方法 [J ]. 第四军医大学学报.2000，21(2)：241-243. ) ( [5]刘保启，张洪香，张树华，等.库仑滴定法测定姜黄素 [J].中华国际医学杂志.2002，2(3)：238-240. ) ( [6]吴伟志，袁翠美.姜黄素的高效液夜色谱分析[J].中 国野生植物资源.1999 ， 18(3)：56-57. ) ( [7]刘保启，胡孝忠，王玉春，等.高效毛细管电泳法测定 ) 酰基-CD能使所研究的3种姜黄素类化合物达基线分离。此法简便、快速、准确，消耗试剂少、测试费用低、具有很大的优越性。 ( 姜黄素中姜姜类化合物[J].分析测试学报，2004，23 (11)：109-111. ) ( [8]主沉浮，林秀丽，魏云鹤，等.新型环糊精衍生物单-6-0苯基胺甲酰基书环糊精的合成及其在寿星药物毛细管区带电泳拆分中的应用[J].分析化学，2003，31 (4)；389-394. ) ( [9] E mmanuelVaresio，Jean Luc Veuthey Chiral separation ofamphetam ines by hi g h-perfommance cap illary electrophore- sis [J]. J Chrom atogr(A) ， 1995，7 1 7：219-228. ) ( [ 1 0] Liu L， O sbome L M，Nussbaum M A . Development andvalidation of a combined potency assay and enantiomericpurity method f or a chiral phamaceutical compound u-sing c ap illary electrophoresis [ J ]. J C hromnatogr (A)， 1996 ， 745：45-52. ) Separa tion and Determ ination of Curcum ins in Curcma aromatica salisbby Capillary Zone Electrophoresis XUE Ling ，LN Xiu-l’， ZHANG Hui- yun， ZHU Chen-fu (1. School of Chinese Phamacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan2250014，China；2. School of Phammacy， Shandong University， Jinan250012， China； 3. School of Chem istry and Chem ical Engineering， Shandong University， Jinan250100，China) Abstract：A capillary zone electrophore sis (CZE) method was developed for the determination and separation of curcum in， deme-thoxy curcum in and bis-demethoxy curcum in in the Chinese herbal extract in Curcuma aromatica salisb from Shandong，Jinan De-tection at 214 nm with a system containing sodium borate buffer and mono-6-O-phenlcarbamoyl-B-CD was found to be the most suit-able app rach for this analysis The three curcum ins could easily be detemm ined within 10 m inutes by this method The effect of pHvalue， the concentration of the running buffer and mono-60phenlcarbamoyl-B-CD on the migration time and resolution of the curcum ins were also discussed Keywords： Curcuma aromatica salisb； Curcum ins； Cap illary zone electrophoresis ( (责任编辑 李 方) ) ◎ China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net