夏枯草中齐墩果酸和熊果酸检测方案(毛细管电泳仪)

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分析试验室ChineseJournalofAnalysisLaboratory第27卷第11期2008年11月Vol.27.No.112008-11 羟丙基-β-环糊精修饰毛细管胶束电动色谱法测定夏枯草中的齐墩果酸和熊果酸 杜 晖，陈晓青 (中南大学化学化工学院，长沙410083) 摘 要：建立了羟丙基-β-环糊精修饰毛细管胶束电动色谱同时分离测定夏枯草中的齐墩果酸和熊果酸的方法。以 pH9.0 的10mmol/LNa，BO、10rmol/LNaH PO、50mmol/L 十二烷基硫酸钠(SDS)、15mmol/L羟丙--环糊精(HP-βCD)、体积分数6%甲醇作为背景电解质溶液，15min内实现了两种待测组分的基线分离。齐墩果酸和熊果酸分别在22.5~360mg/L、48.8~780mg/L范围内线性关系良好，检出限分别为3.2mg /L 和3.8mgL。两者的峰面积和迁移时间的相对标准偏差分别为2.2%、0.5%和2.6%、0.6%， 回收率分别在93.8%~102.1%和96.7%~105.2%之间。 关键词：羟丙基-β-环糊精；毛细管胶束电动色谱；夏枯草；齐墩果酸；熊果酸 中图分类号：0657.8 文献标识码：A 文章编号：10000720(2008)11-062-03 夏枯草(Prunella vulgaris L. ) 是唇形科植物夏枯草的干燥果穗，具有降压、抗炎、抑制免疫、抗菌和降血糖等作用，其中两种主要三萜类成分齐墩果酸和熊果酸已被证实具有抗癌、消炎和抗病毒等作用。 中药中齐墩果酸和熊果酸的分析方法主要有薄层色谱法2、气相色谱法3.4]、高效液相色谱法和毛细管电泳法°等。薄层色谱法简单快捷，但准确性及分辨能力尚有待加强；两者在常规的液相色谱紫外分析中往往达不到基线分离，且受甲醇流动相的干扰较大 。毛细管胶束电动色谱的创立使中性化合物的分析变成可能：而环糊精的疏水性空腔可以选择性地与被分析物形成包合物而导致色谱行为的不同，极大改善了强疏水性化合物、异构体及对映体的分离，从而大大扩展了电泳的应用范围用11，12。论文通过系统研究缓冲液体系及环糊精浓度等因素对两种待测组分分离的影响，建立了羟丙基-β-环糊精修饰毛细管胶束电动色谱法测定夏枯草中齐墩果酸和熊果酸的方法，对中药夏枯草产品的开发和质量评价具有指导 意义。 实验部分 1.1 仪器和试剂 CL1030型高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)，配有诺尔(Knauer)连续可调紫外检测器；静压力进样(高度10cm，时间10s)，分离电压20kV，检测波长210nm，柱温25℃；背景电解质为pH9.0 的10mmol/LNa 2B4O7-10mmol/LNaH PO-50mmol /LSDS -15mmol /LHP -B-CD6%(体积分数)甲醇的缓冲溶液，使用前过0.45um滤膜。未涂层弹性石英毛细管柱(58cm ×50 umi.d.. 有效长度 50cm，1，河北省永年锐沣色谱器件有限公司)；毛细管使用前用0.1mol LNaOH 溶液、水和缓冲溶液分别清洗10min 。在每两次运行之间，毛细管用水和缓冲溶液各冲洗 3min。实验结束后，用0.1mol /LNaOH 溶液和水分别清洗10min，将毛细管吹干保存。 夏枯草为市售药材，经鉴定为Prunella vulgarisL.的干燥果穗；齐墩果酸(Oleanolicacid，OA.)和熊果酸(Ursolicacid，UA)对照品(HPLC纯度≥98%) ( * 收稿日期：2007-05-31：修订日期：2007-07-27 ) ( 作者简介：杜 晖( 1 983-) ， 男，硕士 研究 生；E -mail：xqchen@mail.csu.edu.cn ) 购自成都思科华生物技术有限公司；羟丙基-β-环糊精(HP-B-CD)由德国 Wacker公司提供；其它试剂均为分析纯，水为二次蒸馏水。 1.2 样品制备 将夏枯草在烘箱中60℃干燥24h， 粉碎过孔径380 um筛。准确称量约2.0g粉末，加入30mL石油醚超声10min 后倾出，挥干残留溶剂，再加入50mL95% 乙醇超声提取2次，每次20min，过滤，残留物用少量乙醇清洗。将滤液和清洗液合并浓缩至干，甲醇溶解于10mL 容量瓶中并稀释至刻度。 2 结果和讨论 2.1 分离条件的优化 2.1.1 缓冲盐体系及浓度的影响 分别考察了5~30mmol L 的 NazB407、NaHPO 及 NaB407-NaHPO混合缓冲盐体系对OA、UA标准混合溶液分离的影响，结果表明采用10mmol/LNa 2B40-10mmol/LNaH2PO缓冲溶液时，两组分的迁移时间较短，信噪比最高。 2.1.2 pH的影响 缓冲液体系的 pH 是决定毛细管电泳分离成败的一大关键因素。实验考察了pH在6.0~10.0范围内对OA和UA两者分离的影响。结果发现 pH9.0 左右时，峰形对称无拖尾。 2.1.3 SDS浓度的影响 SDS是 MEKC模式中最常用的一种阴离子表面活性剂，其作用类似于液相色谱的固定相。实验考察了含10~90mmol/LSDS的缓冲溶液对两者的影响，结果表明两组分 的迁移时间和分离度随着SDS浓度的增加而增大，但相应的焦耳热也在急剧增加。综合考虑两者的迁移时间和分离度，选择 SDS浓度为50mmolL。 2.1.4 有机添加剂的影响 由于OA和UA 的强疏水性，实验中分别向缓冲溶液添加了不同浓度的甲醇、乙醇和乙腈。结果发现加入乙醇和乙腈后，OA和UA并不能达到基线分离，体系噪声偏大；加入一定浓度甲醇后，情况得到改善。当甲醇体积分数控制在6%时，基线稳定，峰形较好。 2.1.5 HP-B-CD浓度的影响 由于OA和UA是一对强疏水性同分异构体，只是19和20位上的甲基位置不同。若仅采用MEKC模式，两者的分辨率很差，无法达到基线分离。而 HP-B-CD的疏水空腔可以与疏水性分子形成稳定性不同的包合物，从而使溶质以不同速度迁移。实验了5~25mmo/L的 HP-B-CD对两种三萜酸分离度的影响，结果表明，当缓冲液中 HP-B-CD浓度为 15mmol/L时，两者的分离度达到2.58。 2.2 线性范围、重现性和检出限 在优化的条件下，OA和UA在 15min 内实现了良好的分离，混合标准溶液电泳图如图1(a)所示。以两者峰面积 Y/(uV s)对质量浓度 p/(mg/L)作图。0A和UA分别在22.5~360mg/L和48.8~780mgL范围内线性关系良好。回归方程分别为Y=2461.8+18.4p(r=0.9991)，Y=3629.4+44.7p(r=0.9990)。 将OA、UA混合标准溶液重复进样5次，发现两者的峰面积和迁移时间的相对标准偏差分别为 图1 OA、UA标准溶液(a)和夏枯草样品溶液(b)的电泳谱图 Fig.1 Electropherogramsofastandardmixure(a) andasample(b)1-齐墩果酸；2- 熊果酸 电泳条件：pH9.0 的 10mmol/LNa 2B4O7-10mmol/LNaH2PO-50mmol/LSDS-15mmol/LHP-B-CD6%CH3OH的缓冲溶液 2.2%、0.5%和2.6%、0.6%， 重现性较好。 当S/N为3时，计算出OA和UA的检出限分 别为3. 2mg /L、3.8mg /L. 2.3 样品分析 按上述优化的实验方法分离测定了夏枯草样品溶液中0A和UA，样品溶液电泳图如图1(b)所 示。向夏枯草样品中准确加入一定量的标准溶液后，平行测定5次，计算回收率，测定结果如表1所示。 表1 样品测定结果 Tab.1 Determinationresultsofsamples 成分 测定值w/(mg/g) 加入量 w/(mg/g) 测得量 w/(mg/g) 回收率/% 齐墩果酸 1.11 0.32，0.52，0.96 1.41，1.62，2.09 93.8，98.1，102.1 熊果酸 2.14 0.77，1.12，1.53 2.95，3.27，3.62 105.2.100.9.96.7 ( 参考文献 ) ( [1] 肖培.新编中药志(二).北京：化学工业出版社， 2002.766 ) ( 张秋红，刘素清.时珍国医国药，2000，11 (12)：1133 ) ( JanicsakG，VeresK，KallaiM et al.Chromatographia 2003，58：295 ) ( [41 Perez CaminoMC，CertA.JAgricFoodChem，1999， 47：1558 ) ( [51 ChenJH，XiaZH，TanRX.JPharmBiomedAnal， 2003，32：1175 ) ( [61 刘海兴，杨更亮，赵敬相等.分析化学，2000， 28(10)： 1 275 ) ( 赵宇新，李曼玲.药物分析杂志，2004，24 (2) ： 167 ) ( 叼图 赵永席，马国营，梁 ，恒.中成药，2005，27 (11)：1314 ) ( [9] 傅若农.色谱分析概论(第二版).北京：化工出版 社，2005.236 ) ( 101 童林荟.环糊精化学-基础和应用.北京：科学出版 社，2001.258 ) ( 111 ZhangGQ，QiYP，LouZY et al.BiomedChromatogr， 2005，19：529 ) ( 121 吕元琦，邬春华，袁倬斌.分析化学，2005，33 (6)：805 ) Determinationofoleanolicacidandursolicacidinlaryelectrokineticchromatography ( Prunella Vulgari s L. byHP--CD modifiedmicellarcapil- ) ( DU Hui and C H EN Xiao qing (CollegeofChemistryandChemicalengineering，CentralSouthUniversity，Changsha 410083) ，FenxiShiyanshi，2008，27 (11)：6 2 ~64 ) Abstract： Amethodwasdevelopedtodetermineoleanolicacid (OA) andursolicacid(UA) in Prunella vulgaris L. byHP-β-CD modifiedmicellarcapillaryelectrokineticchromatography (HP--CDMEKO.Thetwocomponentswere baselineseparatedinthebufferof6% (V/V) methanol (pH9.0) containing10mmol /Ldisodiumtetraborate，10 mmo/Lsodiumdihydrogenphosphate，50mmol /Lsodiumdodecylsulfate (SDS) ，15mmol /LhydroxypropylB-cyclodextrin (HP-B-CD) within15min.Agoodlinearrelationshipbetweenthepeakareaandtheconcentrationwasobtainedintherangesof22.5 ~360mg/Land48.8~780mg /Lwiththedetectionlimitsof3.2mg /Land3.8mg /L.theRSDsofpeakareaandmigrationtimeof2.2%，0.5%and2.6%，0.6%forOAandUArespectively.Inaddit ion，therecoverieswereintherangesof93.8% ~102.1%forOAand96.7% ~105.2%forUA，respectively. Keywords HydroxypropyB-cyclodextrin；Micellarcapillaryelectrokineticchromatography； Prunella vulgaris L.，Oleanolicacid：Ursolicacid —China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http：//www.cnki.net