血浆中钾、钙、镁检测方案(毛细管电泳仪)

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2007年第43卷8PTCA(PARTB：CHEM.ANAL.)理化检验-化学分册 理化检验-化学分册冯海燕等：高效毛细管电泳间接紫外检测血浆中钾、钙、镁 试验与研究 高效毛细管电泳间接紫外检测血浆中钾、钙、镁 冯海燕12，侯书荣'，郑 娜，李向军，袁倬斌'* (1. 中国科学院研究生院化学与化学工程学院，北京100049； 2.石家庄学院化工学院，石家庄050035) 摘 要：用高效毛细管电泳法，在pH5.5的缓冲介质中用酒石酸作为络合剂，使血浆中钾、钠、钙、镁4种阳离子达到很好分离，用咪唑作为背景试剂进行了紫外检测。对电泳分离及紫外检测的各分析条件(包括背景缓冲溶液的pH值，咪唑溶液的浓度及酒石酸溶液的浓度等)作了试验并予以优化，上述4种离子的相互分离在4.5min 内顺利完成。文中给出了K*、Ca、Mg的线性回归方程，其相关系数在0.998 4~0.9994之间，证明了在各离子的峰面积与其浓度之间呈线性关系，3种离子的检出限(S/N=3)依次为0.20，0.12，0.06 mg!·L，用迁移时间检测和用峰面积检测所得的 RSD 值(n=6)依次小于0.76%和2.83%。由于钠离子的吸收峰与系统峰重叠，钠的测定无法进行。回收率试验的结果在95.3%至104.2%。 关键词：毛细管电泳；血浆；钾；钠；钙；镁；系统峰 中图分类号：0657.7 文献标识码： A 文章编号：1001-4020(2007)08-0621-03 Indirect Determination of Potassium Calcium and Magnesium in Blood Plasmaby High Performance Capillary Electrophoresis with UVDetection FENG Hairyan2， HOU Shurrong， ZHENG Na'， LI Xiang jun'， YUAN Zhuo bin* Dept. of Chem. and Chem. Engineering， Graduate College， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China；2. Dept. of Chemical Engineering， Shijiazhuang College， Shijiazhuang 050035， China) Abstract ： Potassium sodium calcium and magnesium in blood plasma were separated by high performancecapillary electrophoresis (HPCE) in a buffer medium of pH 5.5， using tartaric acid as complexing agent. Imidazolewas used as background reagent in the UV-detection. Various conditions for the CE separation and UV-detection(including p H value of background buffer solution， concentration of imidazole solution and concentration of tartaricacid solution)were studied and optimized. The above mentioned cations were separated from each othersatisfactorily within 4. 5 min. Linear regression equations showing the relationships between the peak areas andconcentrations of K*， Caand Mg were given with values of correlation coefficients in the range of 0.998 4-0.999 4， and detection limits (S/N=3) of 0.20， 0.12 and 0.06 mg·L respectively. Values of RSD’s (n=6) formeasurments of migration time and peak area were found to be less than 0. 76% and 2. 83 % respectively.Overlapping of the absorption peak with the system peak made the determination of sodium ion impossible. Test forrecovery was performed and values of recovery were found in the range from 95.34 % to 104.29%. Key words ： Capillary electrophoresis； Blood plasma； K*； Na*； Ca+；Mg； System peak ( 收稿日期：2007-03-27 ) ( 基金项目：国家自然科学基金分析化学重点基金(20235010)， 国际合作基金(20611140646)。 ) ( 作者简介：冯海燕(1974-)，女，河北人，博士生，从事毛细管电泳分析。 ) ( *联系人 ) 常机体代谢和生长发育不可缺少的物质。当某一元素过量或缺乏时，机体可能染病。血浆作为血液的重要组成部分，其无机离子的含量对人体的健康起着重要的作用。目前，测定无机离子含量的常规方法主要是原子吸收光谱法，此法操作简单，但常规仪器一次只能测定一种元素，不能对共存的几种元素同时测定。毛细管电泳法(CE)是20世纪80年 代发展起来的一种新的分离分析技术，因其高分辨率、高速度、高灵敏度和样品用量少的特点，已广泛应用于无机离子的分析[2-4]，实际测定样品主要集中在自来水、茶水、雪样、饮料、土壤溶液等样品溶液中无机离子的分析，用于复杂生物样品血浆中无机阳离子测定的报道还很少。De Paz51 和 Qu21对血浆中的金属离子进行过测定，前者不能很好地分离Mg和Na*，后者不能有效分离Ca和Mg'2+Emirhan6]通过在缓冲溶液中加入有机溶剂的方法使血浆中的Mg和Na达到分离。本文系统地优化了K* Na*、Mg、Ca四种金属阳离子的毛细管电泳分离条件，无需有机溶剂，以酒石酸为络合剂就能实现四种离子的基线分离，且具有比文献[6]更低的检出限。运用本方法对血浆中中、钙、镁进行了分离和测定，探讨了金属离子谱峰面积随咪唑浓度的变化关系。 试验部分 1.1 仪器与试剂 CL1020 高效毛细管电泳仪；未涂层熔融石英毛细管(55 cm ×75 um i. d.)，有效长度47cm；pHS-3B型酸度计；Micromax RF 高速冷冻离心机；WFX-130原子吸收分光光度计。 标准溶液：分别称取一定量 K*、Na*Mg2+、Ca的氯化物，加高纯水溶解，配成1.0000g.L标准储备液；使用时稀释至所需浓度并用0.45um滤膜过滤。 酒石酸为优级纯，其它试剂均为分析纯，水为石英高纯水 缓冲溶液：称取咪唑0.06866g和酒石酸0.0633 g加水溶解，用0.1 mol.·L'盐酸调pH值至5.5，定容至100 mL。 1.2 试验方法 1.2.1 样品的预处理 取抗凝静脉鲜血300 uL，以3 000r·min的速率离心10 min，分离血浆；取血浆100uL，加入50g·L'三氯乙酸 300 uL 沉淀蛋白，充分混匀后高速离心10min (10000r·min)，上清液用水稀释6倍后直接上机分析。 1.2.2 电泳操作 毛细管柱在使用前依次用0.1 mol·L-盐酸、0.1mol·L氧氧化钠、水和缓冲溶液清洗。试验前，配制缓冲溶液并超声脱气。两次进样之间用缓 冲溶液冲洗3 min，样品采用虹吸进样，高度10cm，时间5s，分离电压15 kV，214 nm 紫外检测。 2 结果与讨论 2.1 缓冲溶液组成的选择 2.1.1 pH值的选择 溶液的酸度影响金属离子与络合剂之间的络合平衡，并影响本底溶液的电渗流。试验表明：在不同pH值范围内，金属离子的迁移时间随pH的变化趋势有所不同。当pH<4.5时，离子的迁移时间随pH的升高而增加，分离度相应增大；当pH>4.5时，金属离子的迁移时间随pH的升高而减小。因低pH时，溶液的酸度主要影响络合平衡，酸度越小，金属络合物的有效浓度越大，迁移越慢；高pH时，酸度主要影响电渗流，pH越高电渗流越大，相应地离子的迁移速率加快。综合考虑分离度、分离时间等因素，选择pH为5.5。 2.1.2 酒石酸浓度的选择 金属离子大多具有高电荷、低质量迁移率相近等特点，一般很难做到直接分离，加入络合剂可以增大不同金属离子间荷质比的差异，以达到分离的目的。酒石酸作络合剂的文献不多，本文以酒石酸为络合剂，能有效地分开迁移率接近的Mg+Na同时考虑分离时间、峰形等因素，选择酒石酸浓度为4 mmol·Lo 2.1.3 咪唑浓度的选择 咪唑作为间接紫外检测的背景试剂，其浓度直接影响离子的迁移时间6111，试验结果表明：离子的迁移时间随咪唑浓度的增大而增长，但增加的幅度不大。相比而言，咪唑的浓度对峰面积的影响较为显著，当咪唑浓度低于10 mmol·L时，各离子的峰面积随咪唑浓度的增加而程度不等地明显增大；当咪唑浓度达到10mmol·L时，达到最大的峰面积值，再增加咪唑的浓度，峰面积则缓慢下降，选择咪唑的浓度为10 mmol·Lc 2.2 蛋白沉淀剂的选择 血浆中含有蛋白质，在电泳过程中易吸附在毛细管内壁上而干扰色谱分离和检测。试验考察了甲醇、乙醇、50gg·L三氯乙酸对蛋白的沉淀效果。试验结果：三氯乙酸沉淀蛋白能力较强，用量较少，对试验影响小，选择50gL'三氯乙酸沉淀蛋白。 2.3 系统峰 对系统峰的研究最早起于20世纪90年代，是 指与分析样品无关的，由背景电解质浓度的非均一性引起的电泳峰[12]，其具体原因尚在探索之中。本试验中，出现了一个系统峰，进一步验证了Bruin3提出的观点，系统峰大多出现在间接检测中。而且同文献[14]一样，系统峰都与Na*吸收峰发生重叠(图1)。鉴于此本试验未对Na 进行定量分析。 1. K峰(K* peak) 2.Na+与系统系重叠(Overlappingof Na peak with system peak)3. Mg²+峰(Mgpeak) 4. Ca2+峰(Ca2+peak) 图1 四种离子标准混合液的毛细管电泳图 Fig.1 Electrophoregram of mixed standard solution 2.4 工作曲线、检出和重现性 以金属离子的峰面积对浓度进行线性回归，K*Mg+、Ca的回归方程分别为：y=494.76+326.68 x，y=3185.63 x-39.18，y=1705.18+910.27x。当S/N=3时，K*Mg2+、Ca²的检出限依次为0.20，0.06，0.12mg·L.金属离子的峰 面积与其浓度间呈线性关系，相关系数在0.9984~0.9994之间，以标准混合溶液作为试样液，平行测定6次，三种金属离子迁移时间和峰面积的相对标准偏差分别低于0.76%和2.83%。 2.5 样品分析 在选定条件下，对两份人体血浆中的四种金属离子进行分离测定(图2)。依据迁移时间，对样品定性，并根据标准工作曲线计算各离子的含量，计算结果及回收率见表1，并用原子吸收光谱法测定了血浆中 Ca的含量分别为51.09和39.58 mg·L，与本试验结果基本一致(表1)。 1. K+峰(Kpeak) 2. Na*与系统系重叠(Overlappingof Na peak with system peak) 3. Mg2+峰(Mgpeak) 4. Ca²+峰(Ca2+peak) 图2血浆样品的毛细管电泳图 Fig. 2 Electrophoregram of blood plasma sample 表1 血浆中3种离子的测得浓度及回收率和精密度试验结果(n=6) Tab. 1 Concentration of 3 cations in plasma samples found and results of tests for recovery and precision 被测定阳离子 Cation 各离子测定值 Am't of the 标准加入量 回收量 Am't of the cations 回收率 RSD Am't of stds added /(mg·L-) Recovery /% cations found recovered /% determined p/(mg .L-l) p/(mg·L-) 1# 2# 1# 2# 1# 2# 1# 2# 1# 2# K+ 130.80 103.60 19.72 15.78 18.86 15.54 95.6 98.5 1.81 0.84 Mg 17.49 20.72 3.56 4.10 3.42 4.11 96.1 100.2 2.25 2.67 Ca2+ 50.16 40.33 11.09 5.55 11.56 5.29 104.2 95.3 2.15 1.13 ( 参考文献： ) ( [1] 王夔.生命科学中的微量元素分析与数据手册[M].北京：中国计量出版社，1998. ) ( [2 ] QuF ， Lin J M， Ch e n ZL . Sim u ltaneous separation of nine metal ions and ammonium with nonaqueous c a pil- lary electrophoresis[J]. J Chromatogr A， 2004，1022 ( 1 /2)：217-221. ) ( [3] Liu B F， Liu L B ， C h eng J K. An a lysis of inorganiccations as their complexes by c a pillary electrophoresis ) ( [].J Chromatogr A， 1999 ，834(1/2)：277-308. ) ( 41 Timerbaev A R . Element sp e ciation a n alysis by capil-lary electrophoresis [J ] . Talanta，2000，52(4)：573- 606. ) ( [551]De P az E ， Rabanal B ， Negro A. D e termination of cat-ions i n water and biological f l uids b y capillary zone e-lectrophoresis[J]. J Liq Chromatogr R e lated T e chnol，1998 ，21(17) ： 2589-2605. ) ( (下转第634页) ) 得到檞皮素，收率为51.7%。 将银杏叶烘干，研细，准确称取一定量，加入6~8倍银杏叶重的石油醚加热回流1h，冷却后，过滤。取得滤渣，加入10倍的水，室温下浸泡过夜，过滤。取滤渣，加入10倍银杏叶重的95%乙醇溶液，60)℃下加热回流6h，冷却，再过滤。取滤液，真空浓缩，回收乙醇，浓缩物置80℃下干燥，得银杏黄素。收率为1.65%。 称取提取样品0.2000g于小烧杯中，加入少量95%的乙醇溶解后，移入100mL容量瓶中，用95%的乙醇稀释至刻度，摇匀。移取样品溶液0.1mL于25mL 比色管中，按试验方法操作，以试剂空白为参比，测定其荧光强度，从回归方程中计算出横皮素含量，结果见表1。 2.8.3 檞皮素的回收率的测定 将皮素标准加入样品中，按试验方法测定，回收率结果见表1。 表1 样品分析结果(n=8) Tab. 1 Analyt. results of samples 样品名称 试样溶液浓度 皮素测得量 标准加入量 测得总量 回收率 编号 Concn. of Am't of quercetin RSD Am't of std. Total am't Recovery Sample Number sample sol n found /% added found /% name ug/25 mL ug/25 mL pg/25mL ug/25 mL 卢丁 1 204.00 5.85 0.45 1.51 7.33 98.1 2 199.80 5.72 0.64 1.51 7.08 90.1 槲皮素 1 40.00 16.08 0.31 1.51 17.47 92.1 2 45.09 16.12 0.46 1.51 17.49 90.7 银杏黄素 125.00 12.49 0.36 1.51 13.95 96.7 123.00 12.33 0.23 1.51 13.77 95.4 陈皮甙 101.00 6.78 0.36 1.51 8.31 101.3 2 97.80 6.55 0.54 1.51 8.04 98.6 ( 参考文献： ) ( [1] 余琳，尚红霞，邱治平.檞皮素-钨(ⅥI十六烷基三甲基溴化铵荧光光度法测定中药中皮素[J].分析化 ) ( (上接第623页) ) ( [6] Nemutlu E， Cealtm N . D e termination of magnesium， calcium， sodium， and potassium in blood plasma samples by c apillary zone electrophoresis[J]. A n a l Bioanal Chem， 2005 ，383(5)：833-838. ) ( [7] Timerbaev A R. Ca p illary electrophoresis of inorganic ions： An u pdate [J]. 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