免疫球蛋白G中毛细管电泳发光二极管诱导荧光检测方案(毛细管电泳仪)

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第29卷第3期2010年3月分析测试学报FENXICESHI XUEBAO (Joumal of InstrumentalAnalysis)Vol. 29 No.3257~261 258分析测试学报第29卷 毛细管电泳发光二极管诱导荧光对免疫球蛋白 G的检测 甘 杰'，张 丹2，罗岳平，：胡 军，黄东勤 (1.湖南省环境监测中心站，湖南 长沙 410014；2湖南美可达生物资源有限公司，湖南 长沙 410016) 摘 要：采用自行设计、组装的毛细管电泳光导纤维发光二极管诱导荧光检测装置，建立了一种直接测定免疫球蛋白 G(IgG)的方法。以蓝色发光二极管(LED)为荧光检测器的激发光源，荧光素异硫氰酸酯(FITC)为柱前衍生试剂，采用毛细管区带电泳，以20 mmol/L硼砂缓冲溶液(pH 9.2)为背景电解液进行分离检测。通过对衍生反应条件和电泳分离条件进行优化，确定了最佳实验条件，在该条件下，IgG的线性范围为4.5×10-8~1.2×106g/L，检出限为2.0×10-8g/L。该方法简单、高效、选择性好，无需前处理，可用于人血清中 IgG含量的测定。 关键词：免疫球蛋白G；毛细管电泳；发光二极管；荧光检测 中图分类号：0657.7；TQ937 文献标识码：A 文章编号：1004-4957(2010)03-0257-05 doi： 10.3969/j. issn. 1004-4957.2010.03.009 Detem ination of IgG by Cap illary Electropho resis with Optical FiberLight-em itting Diode Induced Fluore scence Detection GAN Jie ， ZHANG Dan， LUO Yue ping， HU Jun ， HUANGDong-qin (11.. Hunan EnvironmentalMonitoring Centre， Changsha410014， China；2Hunan M icolta Bioresource Inc， Changsha 410016， China) Abstract A new method for direct detem ination of IgG without purification was developed by cap il-lary electrophoresis (CE) with op tical fiber light-em itting diode (LED) induced fluorescence detec-tionFluorescence iso thiocyanate(FITC) was selected as precolumn derivatization reagent in cap illaryzone electrophoresis The conditions of derivatization and separation were optim ized The result indicated that the best derivatization conditions was used buffer of 10 mmol/L borate， reaction tme of 16h at room temperature， and the best separation conditions was used a background electrolyte solutionof 20 mmol/L borate buffer(pH 9.2) and separation voltage of 18 kV.Under the op timal conditions，the calibration curve was linear in the range of 4. 5 ×10-8 -1.2 ×10 g/L. The lim it of detectionfor lgG was 2.0 ×108g/L.TThe method showed advantages of simpleness， rapid separation， highsensitivity and without prophase disposal in the system， and could be direct applied in the detectionof IgG in human serum samp le Key words： IgG； cap illary electrophoresis； LED； fluorescence detection 免疫球蛋白(mmunoglobulin，Ig)是一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，普遍存在于人类和哺乳动物的血液、组织液及外分泌液中，其中血清中含量最高。免疫球蛋白作为机体免疫系统的重要组成部分，是所有蛋白质中最不均一的一类，根据其理化性质尤其是免疫学性质，可将其分为5类，即IgG、 IgA、IgM、.ID及 IgE。人体内以IgG为主，其中血清中 IG含量占Ig总量的80%，是免疫学基础研究常用的材料和工具，被广泛应用于医学临床诊断、疾病预防、食品添加、生物制药和疫苗生产领域，而人体血清中 IG含量的测定是临床诊断的重要指标。 IgG的经典检测方法有免疫浊度法[2-4]和非均相酶免疫分析法5-6]，但这些方法需要繁琐的加样、温育和洗涤等步骤，手工操作耗时且精密度差。高效液相色谱法(HPLC)[7-9]和金属螯合色谱法[10-11]分离提取免疫球蛋白，虽然提高了检测灵敏度，但前处理步骤繁琐。而常用的紫外吸收法需对样品 ( 收稿日期：2009-11-03；修回日期：2010-01-28 ) ( 第一作者：甘 杰(1982-)，男，湖南 长 沙人，工程师，硕士， Tel： 0731-825 9 2831， E-mail ： ganji e 1982@163. com ) 进行复杂的纯化操作，可能破坏生物活性和结构。目前，采用毛细管电(CE)或电泳微芯片分析gG的研究多限于血液、体液中IIgG亚结构13-141 IgG纯品15]或临床尿蛋白样本的定性分析沐16] 本文采用自行设计、组装的 CE光导纤维发光二极管(LED)诱导荧光检测装置，建立了直接测定人血清中’IgG含量的方法。以蓝色的 LED 为荧光检测器的激发光源，荧光素异硫氰酸酯(FIIC)为柱前衍生试剂，采用毛细管区带电泳进行分离检测。经过条件优化后，确定了一种灵敏、高效的测定IgG的新方法。 1.1 仪器与试剂 自组装 CE光导纤维LED诱导荧光检测装置，如图1所示。蓝色 LED (深圳世峰科技有限公司，工作电压+3.5V，功率约3mW，激发波长475 mm， 半峰宽约25mm)作为激发光源，将检测窗口部位的聚酰亚胺涂层剥离除去 5mm，用一根直径40um、长20 cm的光导纤维传导激发光源。LED发出的光经100倍的显微物镜(Olympus，日本)聚焦收集后，通过光导纤维传输到毛细管检测窗位置进行衍生物的激发。发射的荧光通过一个40倍显微目镜(Olympus，日本)收集后，依次通过狭缝(0.3mm)和橙色滤光片(最大波长435 mm)到达光电倍增管PMT(购于北京滨松光子技术股份有限公司)。输出信号通过色谱工作站进行数据处理。整个光学系统放置在暗室中，以避免外界光的干扰。 图1CE光导纤维LED诱导荧光检测装置示意图 Fig.1 Schematic diagram of the CE instrument with theop tical fiberLED-induced fluore scence detector optical fiber， 2. detection window， 3.3.、1micro scope objective，4.spatial filter， 5. cutoff filter， 66.PMT， 7. LED， 8.3D shiftplatfomm， 9 electrophoretic capillary， 10Pt electrode， 11..bbufferreservoirs， 12. 1high-voltage paver supply， 13. organic glass cover， 14. computer， 15. cap illary for fixing optical fiber 未涂层石英毛细管65cm(有效长度62 cm) ×75 um i.d.(河北永年光导纤维厂)；高压电源(0~30kV，北京彩陆科学仪器有限公司)； PHSJ-4A型 pH计(上海雷磁有限公司)；；LS-55型荧光磷光发光光度计(美国PerkinEmer公司)；硼砂(NaB0z·10H，O， 广州化学试剂二厂)；荧光素异硫氰酸酯(FITC， 美国 Sigma公司)；免疫球蛋白 G(IgG， 上海科华生物工程公司)；正常人血清为桂林市第五人民医院提供，其他试剂均为分析纯，实验用水为高纯石英亚沸蒸馏水。 IgG标准溶液：用5 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)稀释 IgG标准品，配制成4.6 ×10 g/L的IgG标准溶液：FITC溶液：准确称取FITC标准品，用丙酮溶解，配制成5×10mol/L的FITC溶液，置于冰箱中4℃保存。人血清：用0.45 um滤膜过滤后再用生理盐水稀释10000倍。 1.2 柱前衍生 取2uL待测IIG标准样品或人血清于 500 uL离心管中，加入80 uL 5 X10mol/L的 FITC丙酮溶液，再加入10 mmol/L硼砂缓冲溶液(pH9.5)至100uL，于暗处室温下反应14~16 h。分析前用缓冲溶液稀释至所需浓度后进样测定。 1.3 毛细管电泳 新毛细管依次用 1mol/L HCl溶液、亚沸蒸馏水和1mol/L NaOH溶液各冲洗 30min。每两次测定之间分别用亚沸蒸馏水、0.1mol/LNaOH和电泳缓冲溶液各冲洗2min。电泳缓冲溶液为20mmol/L硼砂溶液(pH9.2)，样品采用重力进样(抬高15 cm)15s，运行电压为18kV。每天实验结束后，依次用0.1 mol/L HC1溶液、亚沸蒸馏水、0.1mol/L NaOH溶液和亚沸蒸馏水各冲洗毛细管2min。 2 结果与讨论 2.1 发光二极管的选择 进行荧光检测时，光源的发射波长必须与荧光衍生物的激光波长相匹配，才能有效激发衍生物， 获得高的激发效率。为提高检测灵敏度，需对发光二极管进行选择。通过荧光光度计获得了 FITC -IG的激发和发射光谱，结果见图2。由图可知FITC- IgG的最大激发、发射波长分别为495、516mm。由于荧光化合物的最大激发和最大发射波长仅存在较小差异(21nm)，如果选用最大发射波长在495 mm的LED， 将会造成LED的发射光谱与 FITC-IgG的发射光谱约有35%的重叠，从而引起较高的背景和噪音，对检测产生较大影响。FITC- IgG的激发光谱在465~475nm处有一肩峰，当采用475 mm的蓝色LED激发FITC-IgG时，虽然其激发 图2 FITC-IgG的激发与发射光谱 Fig.2 Excitation and emission spectra of FITC- IgG1.excitation spectrum， 2.emission spectrum 2.2 衍生反应条件的优化 2.2.1 缓冲溶液的浓度 为了与 CE的背景电解质兼容，保持基线稳定，实验采用硼砂为衍生反应的缓冲溶液分别选用5、10、15、20、25、30、40、50mmol/L的硼砂缓冲溶液(pH9.2)对相同浓度的IG标准品进行衍生。结果发现，硼砂溶液的浓度对 IgG衍生物的荧光强度影响很小。但硼砂浓度为5mmo1/L时，IgG主生物的荧光强度最小。而较高浓度又会使体系的离子强度增大，将在 CE分离中产生较强的电动迁移扩散，导致分辨率下降，对混合物分离不利。为使 CE分离有良好的分辨率，选用10mmo1/L硼砂缓冲溶液用于衍生反应。 2.2.2 缓冲溶液的 pH值 采用不同 pH值的10 mmo1/L硼砂溶液作为衍生反应的缓冲液，在室温(25℃)下对 IgG进行衍生反应，16h后进行 CE分离。结果表明，当pH值为9.5时 IgG衍生物荧光强度较高，因此将衍生反应中硼砂缓冲溶液的pH值定为9.5。 2.2.3 反应温度及时间 根据 FITC作为衍生试剂进行衍生的研究报道118，选择衍生反应在室温(25℃)下避光反应16 h。在此条件下，，IgG衍生物的荧光强度高，且副产物少。将储存在4℃冰箱中48h后的衍生物溶液进行 CE分析，发现 IgG衍生物的峰高没有明显变化，说明衍生物的稳定性良好。 综上，衍生反应的最佳条件为： 10 mmol/L硼砂缓冲溶液(pH9.5)，室温(25℃)避光反应16 h。 2.3 CE分离条件的优化 2.3.1 缓冲溶液的浓度及pH值 硼砂溶液作为毛细管电泳的背景电解质具有电渗流稳定、背景噪声小的优点。因此，实验采用硼砂作为 CE的背景电解质。在电压不变的情况下，用不同浓度(10、15、20、25、30、40、50 mmol/L)的 pH 9.2硼砂缓冲溶液作为背景电解质进行考察。结果发现，当硼砂浓度为 20 mmol/L时，分离度最大，峰高最强。因此选定硼砂缓冲溶液浓度为20mmol/L，在此基础上，考察了不同 pH值(8.5、9.0、9.5、10.0)对 FITC-IgG分离的影响。结果表明， pH为9.2时分离效果 2.3.2 分离电压对分离的影响 电渗流与电场强度成正比，分离电压增大，电渗流也变大，衍生物的迁移时间缩短，但分离度下降。同时，电压增大产生的焦耳热也随之增大，使得峰扩张而造成分离度降低。实验考察了15、18、20、22、25kV运行电压对分离的影响。结果显示，电压为18kV时，分离效果良好，因此选择 CE的运行电压为18 kV。 综上，CE的最佳分离条件为：20mmol/L硼砂缓冲溶液(pH9.2)，分离电压为18kV。图3为优化条件下IgG标准品衍生物的电泳谱图。 图3 7.5 X10’g/L FITC- IgG的毛细管电泳图 Fig.3 Electrophoregram of FITC - labeled IgG concentration of IgG： 7.5 X10-7g/L；electrolyte composition： 20 mmol/L boratebuffer(pH 9.2)； applied voltage： 18 kV 2.4 工作曲线、线性范围与检出限 在优化实验条件下，对一系列IgG的 FITC衍生物溶液进行 CE分离，以峰高对IgG的质量浓度进行线性回归分析。结果表明，gG的质量浓度在4.5×10-8~1.2×106g/L范围内与荧光强度(峰高)呈良好的线性关系，线性回归方程为(mV)=99.567p(10"’g/L)+5.195， r=0.9993c IgG的检出限(S/N=3)为 2.0 ×10g/L. 在优化的条件下，以4.0 X10'g/L的 IgG标准品连续进样6次，记录峰高和迁移时间，计算其相对标准偏差分别为3.1%、3.5%，表明该方法具有良好的重复性。 2.5 样品分析 对6个成年人血清中的IgG含量进行了测定，典型的电泳图如图4A所示。为考察图4A标示 gG峰的可靠性，在人血清样品中加入 IG标准溶液，重新对样品进行衍生、分离和检测，得到加标后的电泳图(见图4B)。比较图4A、B可以看出，谱图4B中IIgG荧光峰的峰高增加，而其它峰没有发生明显变化，进一步表明图中标示的峰即为 IG的峰。在优化的条件下，对试样连续进样4次，测定样品中IgG的平均含量，并通过标准加入法对该方法的可靠性进行考察，结果见表.1。发现人血清中 IG的质量浓度为5.81~11.25 g/L，实验结果与文献[3]报道一致。将各血清样品在1个工作日内重复分析4次，相对标准偏差为3.1%~4.6%，人血清的加标回收率为95%~104%。 图44人血清样品(A)及人血清样品中加入 IgG(B)的毛细管电泳图 Fig.4 Electrophoregram s of human serum (A) and human serum added IgG(B)experimental condition were the same as those in fig. 3 表11人血清中 IgG的测定结果 Tabel1 Analytical results of IgG in human serum No. Detemm ined RSD(n=4) Added Found Original p/(10-8g·L1) s./% 0/(10-8g·L-) pr/(10-8g.L-) Recovery R/% p/(g·L-I) 1 6.63 4.2 8.00 14.86 103 6.63 2 5.81 3.8 8.00 13.65 98 5.81 3 11.25 3.1 8.00 19.01 97 11.25 4 7.89 4.6 8.00 16.21 104 7.89 5 10.07 3.5 8.00 17.89 98 10.07 6 6.27 4.1 8.00 13.85 95 6.27 3 结 论 本文采用自行设计、组装的 CE光导纤维 LED诱导荧光检测装置，以蓝色LED 为激发光源，建立了IgIgG的测定方法，并对人血清中的勺IgG含量进行测定。方法具有简便、快速、经济、灵敏度高、选择性好等特点，为直接应用于人血清中 IgG含量的测定提供了一种经济实用的方法。 ( 参考文献： ) ( 马玉平，宋淑珍.牛初乳中免疫球蛋白 IgG的检测[J].黑龙江畜牧兽医，2002，9(4)：25-26. ) ( 21 RAMMELOO T， BEUNISM H. 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