金诃天根胶囊中腺苷检测方案(液相色谱仪)

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HPLC法测定金诃天根胶囊中腺苷的含量 （上海禾工科学仪器有限公司提供） 摘要：目的：建立金诃天根胶囊中腺苷的含量测定方法。方法：HPLC法测定金诃天根胶囊中腺苷的含量。采用C18柱，以0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇(90：10)为流动相，检测波长260nm。结果：此方法线性关系良好(r=0.9999)，平均回收率为100.3％，RSD=0.79％(r=5)。结论：本方法简便，稳定，能有效地控制该制剂的质量。 关键词：腺苷；金诃天根胶囊；HPLC 金诃天根胶囊是由冬虫夏草[麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis(Brek．)Sacc．寄生在蝙蝠娥科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体复合体]、喜玛拉雅紫茉莉[紫茉莉科植物喜玛拉雅紫茉莉Mirabilis himalaica(Edgew．)Heim．的干燥根]、西藏迷果芹[伞形科植物迷果芹Sphallerocarpus gracilis(Bess．)k-po1．的干燥根及根茎]、手参[兰科植物手参Gymnadenia conopsea(L．)R．Br．的干燥块 根等9味藏药组成。其处方最早收载于《四部医典》，由此加减制成的一种复方藏药制剂。具有滋补肝肾，益精培元，延缓衰老等功效。用于治疗虚劳导致的疲劳综合症，腰膝酸痛，夜尿频多等症状。方中君药冬虫夏草的主要成分为腺苷，2000版中国药典 及文献报道 均采用高效液相色谱法测定腺苷的含量。在实验中曾采用上述2种方法检测，结果峰形对称性不好，严重拖尾且有一干扰峰，为此我们试寻找适宜的提取条件及色谱条件进行测定，取得了比较好的效果，为藏药制剂的质量控制方法提供了一定的依据。 1 仪器与试药 惠普1100高效液相色谱仪，惠普1100检测器，TU-1201型紫外分光光度计(北京通用仪器厂)，腺苷对照品(购自中国药品生物制品检定所，纯度99％以上，供含量测定用，批号：879-200102)，水为重蒸馏水。甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。金诃天根胶囊样品5批(由青海省金诃藏药药业有限公司提供)。 2 实验条件 2．1 供试品提取溶剂的选择 由于方中的腺苷含量较低，干扰成分多，曾采用药典方法及文献报道的方法，用90％甲醇和15％甲醇提取，均分离不好，拖尾严重，，后经多次试验，采用90％甲醇超声提取后；蒸干；加0.O1 mol/L磷酸三钠溶液溶解，进行检测，峰形的对称性比较好，并消除了腺苷峰的拖尾现象及干扰峰，取得了较好的分离效果。 2．2 测定波长的选择 取腺苷对照品适量，加90％甲醇溶解后，蒸干，残渣加0.01mol/L磷酸三钠溶液制成25μg/mL对照品溶液，置紫外分光光度计记录紫外吸收光谱。结果显示，腺苷在260nm波长处有最大吸收，故选择260nm为测定波长。 2．3 流动相的选择 以药典方法的流动相：磷酸盐缓冲液(pH 6.5)[取0.01mol/L磷酸二氢钠68.5mL与0.01 mol/L磷酸氢二钠31.5mL，混合，调pH 6.5]-甲醇(17：3)，及文献报道中的流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾-甲醇(87：13)，经这2种流动相的试验，选择0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇为流动相，以不同比例进行反复试验，确定比例为(90：10)时峰形及出峰时间适宜。 3 试验方法与结果 3．1 分析溶液的制备 3．1．1 对照品溶液的制备精密称取以五氧化二磷为干燥剂减压24h的腺苷对照品8mg，加入0.01mol/L的磷酸三钠溶液溶解，并定容稀释至25mL，摇匀，作为对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液4.0mL，加0.01mol/L磷酸三钠溶液稀释至25mL量瓶至刻度，摇匀，作为对照品溶液。 3．1．2 供试品溶液制备取本品内容物适量，研匀，精密称取8g，精密加入90％甲醇50mL称定重量，超声处理30min，取出，放冷，称定重量，补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25mL，水浴上蒸干，残渣加0.01 mol/L磷酸三钠溶液溶解，置于5mL量瓶中并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。 3．1．3 阴性对照品溶液的制备 按处方比例称取除去冬虫夏草的其它药材适量，依照金诃天根胶囊的制备工艺和供试品溶液的制备方法，制成阴性对照品溶液。 3．2 色谱条件色谱柱：Exsil ODS 4.6mm×250mm，5μm。流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾溶液-甲醇(90：10)，检测波长：260nm，柱温：23℃，流速：1mL/min。 3．3 分析方法学考察 3．3．1 系统适应性试验 在上述色谱条件下，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液、阴性对照品溶液各10μl，分别注入色谱仪。供试品色谱图中，在与对照品色谱图相应保留时间上，有一相同的色谱峰，而阴性对照品在此无干扰。 3．3．2 线性关系考察 分别精密吸取腺苷对照品贮备液1，2，4，6，8mL置25mL量瓶中，加0.01mol/L磷酸三钠溶液稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取各10μl进样，在上述色谱条件下，测定峰面积，求得回归方程：Y=0.5193+4.0218X r=0.9999 实验结果表明：腺苷在0.128mg/mL～1.024mg/mL范围内有良好的线性关系。 3．3．3 精密度实验 精密吸取腺苷对照品溶液10mg/mL，连续进样5次，测得腺苷峰面积为2003.28，1984.48，1995.49，1993.47，2008.65，平均峰面积为1997.074，RSD=0.46％ 。 3．3．4 重复性实验 取同一批号的样品5份，按“3．1．2”项下的方法制成供试品溶液，在上述色谱条件下，测定腺苷的含量分别为0.1135mg/mL、0.1178mg/mL 、0.1162mg/mL、0.1139mg/mL、0.1131mg/mL，平均含量为0.1149mg/mL、RSD=1.76％。 3．3．5 稳定性实验 取同一供试品溶液10μl，每隔2h进样，测得腺苷峰面积分别为3585.25，3625.67，3546.96，3577.17，3621.89，平均峰面积为3591.39，RSD=0.91％。结果表明：供试品溶液在8 h内所测得结果基本一致。 3．3．6 加样回收率实验 精密称取已知腺苷含量 的样品5份，约4g，分别加入一定量的腺苷对照品0.48 mg，按“3．1．2”项下的方法制成供试品溶液，并按上述色谱条件测定腺苷的含量，计算回收率。结果平均回收率为100.3％，RSD=0.79％(n=5)。 3．3．7 样品测定 取批号不同的样品5批，按“3．1．2”项下的方法制成供试品溶液。精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入色谱仪，按上述色谱条件测定，计算腺苷的含量。测定结果。 4 讨论 4．1 与药典和文献相比，本实验在提取方法上进行了优化，对超声波法、回流提取法进行比较，结果本文选择的超声30min效果最好。曾对磷酸三钠的浓度，甲醇提取的浓度进行了比较分析，结果表明90％甲醇比15％甲醇提取完全，然后改用磷酸三钠溶液溶解进样，可改善峰形，消除拖尾及干扰峰。但如果磷酸三钠的浓度过大，对色谱柱的损害会比较大，故选用浓度0.01mol/L。 4．2 用磷酸三钠溶液溶解供试品进样检测时，流动相的比例对腺苷的分离及峰形有一定的影响。经多次实验，流动相中的0.05mol/L磷酸二氢钾-甲醇的比例应控制在(90：10)比较好。 4．3 本方法简单、稳定，为复方藏药制剂的质量控制提供了一种有效的分析方法。 参考文献 1 Qinghai Institute Tibetan Medical＆Pharmaceutical Sciences，Qillgilai Institute for Drug Control(青海藏医药科学研究所，青海药品检验所)．ChinaTibetan Medicine(中国藏药)．Shanghai(上海)：Shanghal Technology Pubhshing House(上海科学技术出版社)，1996．85，303，341，344