烟草中芦丁含量检测方案(液相色谱仪)

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准确度试验 讨论与建议 液相色谱法分析烟草中绿原酸和芦丁含量 袁斌金燕 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 烟草中含有多种多酚类化合物，为烟草产生香味的主要前体物，其种类和含量随物种和地域分布存在密切关系，其中绿原酸和芦丁占有主要部分“。现代药理学研究表明绿原酸、芦丁等多酚类化合物具有抗氧化作用，可降低血管脆性，增加细胞膜渗透性能，提高细胞排泄生理体液等功能，已广泛用于医药、食品等行业2.3。烟草中多酚类化合物的检测方法有分光光度法、、“气相色谱法、液相色谱法等。其中分光光度法专属性差且只能测定其近似总量；气相色谱法则需要将样品进行衍生后才能分析；传统液相色谱法需要用有机溶剂进行脱脂处理，样品处理较繁琐ω。本研究对烟草中2种多酚化合物提取方法进行了优化设计，并采用反相液相色谱方法测定烟草中绿原酸和芦丁含量。其分析结果与发表相关标准的方法相比，该方法灵敏度高、检出限低、峰形对称、分析时间短。 仪器配置 Thermo Ultimate 3000系统： 泵： LPG-3400 自动进样器：WPS-3000 柱温箱： TCC-3000 检测器： DAD-3000 色谱软件： Chromeleon 6.8 测试条件 色谱柱： Acclaim 120° C18， 4.6×150mm，5um， PN：059148，SN：003887 流动相：A：0.1%磷酸溶液，B：甲醇梯度程序：0~10min：20%→30%；10~25min：30%→90%B；25~27min：90%B；27~28min：90%→20%B；28~32min：20%B 进样量：10pl 柱温：35℃ 检测波长：325mm 样品处理 精密称取 0.5g样品粉末置于50ml量瓶中，加入55%甲醇20ml，超声提取30min， 放置室温，过滤，取2ml滤液用20%甲醇稀释至10ml，摇匀备用。 通过查阅文献16-8，对提取溶剂浓度和用量进行了考察(表1) 表1.提取实验方案 序号 甲醇浓度(%) 体积(ml) 1 30 10 2 30 20 3 30 30 4 50 10 5 50 20 6 50 30 7 70 10 8 70 20 9 70 30 结果显示，当甲醇浓度为50%时，两种成分的含量达到最大值，增加甲醇浓度时，绿原酸含量不再增加，芦丁含量会有降低趋势。当溶剂体积为20ml时，两种成分含量达到最大值，再增大溶剂用量，，.二者含量不再增加。通过数据分析(见图1)，决定采用55%甲醇20ml可最大程度提取烟草中的绿原酸和芦丁两种成分。 专属性试验 分别进样空白溶剂、对照品和样品溶液进行分析，结果见 图2，表明空白溶剂无干扰，且样品中目标峰与相邻峰达到基线分离，不影响分析结果。 图2.专属性实验图谱 线性范围考察 精密称取绿原酸对照品 2.8mg，芦丁对照品1.1mg，用50%甲醇制成4种水平的混合标准品溶液，绿原酸和芦丁浓度分别为：28/11，84/33，140/55，224/88，280/110ug/ml。通 过标准溶液逐步稀释法，测定二种成分的最低检出限。按照由低到高的顺序依次进样，测定其峰面积，并与相应浓度做线性回归，结果见图3与表2。 图3.绿原酸与芦丁校准曲线图 表2.绿原酸与芦丁校准结果 时间(min) 校准类型 水平点数 斜率 截距 相关系数(%) 7.30 线性，有截距 5 0.3958 0.2440 99.9058 16.85 线性，有截距 5 0.1053 0.0177 99.9207 重复性试验 取对照品溶液，连续进样5针，计算其保留时间和峰面积RSD%，结果见图4。 图4.重复性实验室图谱 结果计算为保留时间与峰面积RSD%分别为 0.18%和0.32%，表明方法重现性良好。 平行称取三份样品(0.25g)，然后向样品中加入混合标准品 其中绿原酸和芦丁的含量，结果见图5与表3。溶液2ml，按照“试验部分”条件进行样品处理，并测定 图5.回收率试验图谱(1.未加标样品2.加标样品) 表3.加标回收试验 No.# 绿原酸 含量(pg/ml) 加入量(ug/ml) 总量(ug/ml) 回收率(%) 1 14.52 14.0 28.45 99.6 2 14.62 14.0 28.53 99.4 3 14.85 14.0 28.83 99.8 取不同产地样品按照“实验部分”条件下测定绿原酸和芦丁的含量，结果见表4。 产品编码 绿原酸(mg/g) 芦丁 (mg/g) XDJL-X2F-Y97 13.712 20.420 XDJL-X2F-Y87 14.931 22.121 XDJL-C3F-Y87 17.279 24.366 XDJJ-C3F-Y87 14.764 21.918 XDJJ-X2F-Y87 12.294 20.989 XDBP-C3F-Y87 14.859 24.092 通过前述方法学研究表明，该方法具有专属性良好，准确度高，重复性强，灵敏度高，可用于烟草中绿原酸和 ( 参考文献 ) ( [1]左天觉著，朱尊权等译烟草的生产、生理、生物化 学上海：上 海 远东出版社，1993：396~398 ) ( [2]吴继州，孔令义天然药物化学北京：中国医药科技 出版社，2008：188~202 ) ( [3] Chotinuchit ， P.， and S. vorabhleuk. Studies on Phenolic C ompounds in T hai Flu e -cured Tobacco. Thai j. Agr. Sci.1986.19：147~154 ) ( [4]李汉超，王淑娴烟气及烟草化学成分分析郑州：河 南科技出版社，1991：100~102 ) ( [5]国家烟草专卖局， YC/T 202-2006 烟草及烟草制品中多 酚类化合物测定，2 0 06 ) ( [6]白长敏，钟科军，黄建国等高效液相色谱-二极管阵列同时测定烟草中多酚类化合物，分析化学， 2006，34(11) ： 255~259 ) ( [7] Raymond H. Myers， Douglas C. Montgomery， Christine M. Anderson-Cook. Response Surface Methodology(3rd edition)， Wiley-Interscience， New York， 2009 ) ( [8] Sergio Luis Costa Ferreira， Roy Edward Bruns， Erik GalvaoParanhos da Silva，et al. J. Chromatography A， 1158(2007)：2~14 ) SCIENTIFI C AN_C_LC-       烟草中含有多种多酚类化合物，为烟草产生香味的主要前体物，其种类和含量随物种和地域分布存在密切关系，其中绿原酸和芦丁占有主要部分[1]。现代药理学研究表明绿原酸、芦丁等多酚类化合物具有抗氧化作用，可降低血管脆性，增加细胞膜渗透性能，提高细胞排泄生理体液等功能，已广泛用于医药、食品等行业[2,3]。烟草中多酚类化合物的检测方法有分光光度法、气相色谱法、液相色谱法等。其中分光光度法专属性差且只能测定其近似总量；气相色谱法则需要将样品进行衍生后才能分析；传统液相色谱法需要用有机溶剂进行脱脂处理，样品处理较繁琐[4]。本研究对烟草中2 种多酚化合物提取方法进行了优化设计，并采用反相液相色谱方法测定烟草中绿原酸和芦丁含量。其分析结果与发表相关标准的方法[5]相比，该方法灵敏度高、检出限低、峰形对称、分析时间短。