乳与乳制品中三聚氰胺检测方案(固相萃取仪)

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GB/T××××—×××× GR/T0004—2008 乳与乳制品中三聚氰胺残留的测定—高效液相色谱法 1 范围 本方法规定了用HPLC与GC-MS测定三聚氰胺的方法。 本方法适用于乳与乳制品中三聚氰胺含量的测定。 本方法三聚氰胺的最低检出限为1.0mg/kg。 11　规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 NY/T 1372-2007 饲料中三聚氰胺的测定 GB5009.1 食品卫生检验方法理化部分总则 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 2 原理 试样中的三聚氰胺用乙腈、水的混合溶液萃取，乙酸锌溶液沉淀蛋白质后，提取液经混合型阳离子交换固相萃取柱净化，净化液用高效液相色谱进行测定，外标法定量。 3 试剂与材料： 除另有规定外，试剂为分析纯，水符合GB/T6682规定的三级水，色谱用水符合一级水的规定。 3.1 乙腈：色谱纯 3.2 甲醇：色谱纯 3.3 氨水：浓度25%～28% 3.4混合型阳离子交换固相萃取小柱：60mg/3mL 3.5 三氯乙酸溶液10g/L ：称取10g三氯乙酸加水至1000mL。 3.6 乙腈水溶液：乙腈:水为50：50 3.7 盐酸溶液：0.1mol/L 3.8 氨水-甲醇溶液：量取5mL 氨水，溶解于100mL 甲醇中。 3.9 乙酸锌溶液219 g/L：取219g乙酸锌用300mL 水溶解后，定溶至1L。 3.10 20%甲醇溶液：200mL 甲醇，溶解于800mL 水中。混匀。 3.11缓冲液：10mmol/L辛烷磺酸钠，10mmol/L柠檬酸，调pH3.0。 3.12标准溶液： 3.12.1 标准贮备液1mg/mL ：称取100.0mg与小烧杯中，加少量乙腈: 水40:60溶解并转入100mL 容量瓶中定容。 3.12.2标准工作液10µg/mL ：准确吸取标准贮备液1mL 于100mL 容量瓶中，用乙腈: 水40:60定容。 4 仪器设备 实验室常用仪器及： 4.1 液相色谱仪 4.2 超声波振荡器 5 操作步骤 5.1 试样提取： 称取5g试样（精确到0.01g）与150mL 三角瓶中,加入50mL三氯乙酸溶液(3.5)或乙腈水溶液溶解样品,放于超声波振荡器中超声萃取30min。取出加入5mL 乙酸锌溶液（3.9），前者采用三氯乙酸溶液(3.5)、后者采用盐酸溶液（3.7）将试样转入100mL 容量瓶中定容至刻度，混匀后用滤纸过滤。 5.2净化 分别用3mL 水，3mL 甲醇活化混合型阳离子交换固相萃取小柱后。取2mL 滤液上柱，然后分别用3mL 甲醇和3mL 水淋洗，将淋洗液全部抽干后，用3mL 氨水-甲醇（3.8）洗脱，洗脱液于50℃水浴中旋转蒸发至干。用20%甲醇溶液定容至1mL ，漩涡震荡1min，过0.45um滤膜过滤，上机测定。 5.3 测定 5.3.1 色谱条件 色谱柱：极性 C8柱(4.6mmi.d.×250mm,5µm)或C18柱（4.6mmi.d.×250mm,5um）； 流 速：1.0mL /min； 进样量：50µl； 柱 温：35℃； 波 长：240nm. 流动相：C8柱使用的为缓冲液（3.11）：乙腈=95:5； C18柱使用的为缓冲液（3.11）：乙腈=90:10； 5.3.2 标准曲线绘制 分别吸取标准工作液（3.12.2）0.5、2.0、4.0、7.5、10.0mL于50mL 容量瓶中，用乙腈: 水40:60分别定容混匀，该标准系列浓度分别为0.10、0.40、0.80、1.50、2.00µg/mL。将该标准系列溶液分别注入仪器中，测定峰高（或峰面积）。以标准系列浓度为横坐标，峰高（或峰面积）为纵坐标绘制标准曲线。或计算回归方程。 5.3.3测定 分别吸取试液（5.2）注入仪器中，测定峰高（或峰面积）。由标准曲线查得试液中三聚氰胺的浓度或通过回归方程计算出试液中三聚氰胺的浓度。 6 结果表示 6.1 试样中三聚氰胺的含量X，以质量分数毫克每千克（mg/kg）表示 ………………………………（1） 式中： Cs—试液中三聚氰胺的浓度，（µg/mL ）; V—试液体积，（100mL ）; m—试样的质量，（g）; n—稀释倍数； 6.2 平行测定结果用算术平均值表示，结果保留小数点后两位有效数字。 7 精密度 在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的两个平行测定相对偏差不大于10%。 A.2 婴幼儿配方奶粉和牛奶中三聚氰胺的高效液相色谱筛选法 1方法来源 本方法是在参考FCC三聚氰胺检测方法[Updated FCC Development MelamineQuantitation（HPLC—UV），April2，2007]，FDA三聚氰胺检测方法 [GC-MS Screen for the Presence of Melamine ，(Adapted from FDA/ORA Forensic Chemistry Center SOP T015) Revised April 10, 2007]的基础上，综合制定而成的婴幼儿配方奶粉和牛奶中三聚氰胺高效液相色谱筛选方法。 2 试剂 1.1 磺基水杨酸：分析纯； 1.2 柠檬酸：分析纯； 1.3 辛烷磺酸钠：高效液相色谱离子对试剂； 1.4 乙腈：色谱纯； 1.5 盐酸：分析纯； 1.6 超纯水：18.2MΩ； 1.7 60g/L磺基水杨酸：称取60g磺基水杨酸用水定容至1L； 1.8 0.1N HCl：量取8.3mL盐酸用水稀释至1L； 1.9 标准储备液：精密称取三聚氰胺0.0100g，用甲醇配制成浓度为1mg/mL标准储备液。 2.0 标准使用液：将标准储备液用甲醇逐级稀释至适宜浓度。 3仪器 高效液相色谱，附二极管阵列检测器 4样品处理 2.1 配方奶粉：称取0.5g样品，加入0.1N HCl约15mL，涡旋混匀，超声提取30min后加入60g/L磺基水杨酸3~4mL，用0.1N HCl定容至25mL，混匀后离心，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤后进样。 2.2 牛奶：称取15g左右样品，加入60g/L磺基水杨酸3~4mL，用0.1N HCl定容至25mL，混匀后离心，上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤后进样。 5 参考色谱条件 4.1 色谱柱：ODS C8，250mm×4.6mm 4.2 流动相：缓冲液：乙腈=85：15，等度洗脱 4.3 缓冲液：10mM柠檬酸+10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0 4.4 流 速：1.0mL/min 4.5 柱 温：40 ℃ 4.6 波 长：240nm 6 计算公式 C×V X = ———— M 式中：X—样品中三聚氰胺含量，mg/kg； C—从标准曲线上查出的含量，μg/mL； V—定容体积，mL； M—称样量，g。 7定量限 本方法的定量限为1mg/kg 8 参考色谱图和光谱图 标准色谱图 三聚氰胺光谱图 II 1