精油中芳樟醇检测方案(制备液相色谱)

智能文字提取功能测试中

「应用纪要THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. [应用纪要] ■ Waters 通过SFC对挥发性风味物质和香味物质进行手性纯化 Jacquelyn Runco、 John McCauley 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用优势 Investigator SFC系统可实现简化的手性分离，还可用于纯化和回收挥发性化合物，无需制备型气气色谱(GC)中必需的复杂样品捕集。 SFC比GC具有更高的载样量和更短的运行时间。 超临界流体色谱(SFC)使用较低的色谱操作温度，这种温度更适合挥发性和不稳定化合物，可提高风味物质和香味物质纯化中固有的低回收率。 SFC手性纯化方法使用无毒乙醇和CO，作为流动相，这对于供人使用或消费的化合物纯化而言至关重要。 Investigator SFC系统可通过使用重迭进样提升采集效率，从而提高通量。 沃特世解决方案 Waters Investigator SFC系统ChromScopeMv1.2版 关键词 风味物质，香味物质，挥发性，纯化，手性，精油 简介 食品、酒、香料、香水和精油中的风味物质和香味物质在自然界十分常见，这些物质有助于提升生活品质1。通常情况下，这些化合物为具有足够挥发性的小分子，可通过味道或气味来感知。它们涵盖了包括松油烯、酚、醛和酯在内的多种化学物质，其中许多都是手性物质²。风味物质和香味物质可通过天然来源、化学合成或发酵获得，行业必须确保不断获取新的经验才能获得新鲜和愉悦的化学感官1.2。 经过长期观察研究证实：化合物与生物系统的相互作用具有立体选择性3。正如手性药物对映体表现出不同的药理活性，，手性在风味物质和香味物质化学中也起着重要作用4。这些手性对映体不仅代表了味道或气味品质，还可以表明强度。因此，化学家花费很多精力来研究纯对体手性风味物质和香味物质5，注意确保仅添加所需的气味或风味活性异构体以减少毒理学风险，尤其是满足食品和饮料行业中的严格规定。为此，需要高纯度的化合物，并且制备期间不允许使用毒性化学物质。 许多风味物质和香味物质通过简单的分馏进行纯化。然而，该技术与色谱方法具有不同选择性，也无法区分手性对映体。目前，用于纯化风味物质和香味物质的最常用方法是制备型气相色谱法。虽然这种技术对于这些类型的挥发性化合物具有极高的分离度，但通过气相色谱实现纯化可能面临很大挑战：由于毛细管柱的的限性使得载样量较低；由于较长的运行时间，数小时内往往仅能收集几微克物质；同时由于气相色谱条件中的高温增加了样品损失和降解的风险。为了通过气相色谱实现馏分收集，需要冷却(通常使用液氮)捕集阱，如果样品中存在多种目标化合物，则需要多个捕集阱6。 实验 制备型SFC条件 SFC系统： Waters Investigator SFC系统 制备柱： CHIRALPAK AD-H， 5 pm， 10x 250 mm 流动相A： CO， 流动相B： 乙醇 补偿溶剂： 乙醇 流速： 12mL/min 附加条件： 记录在表1中 馏分分析 在相同的Investigator SFC系统上使用5 pm，4.6x250 mm CHIRALPAK AD-H柱进行馏分分析。对于回收率研究，将经稀释的对映体馏分的面积与对照样品的面积进行比较。针对所有杂质(对映体或基质)，对精油的未稀释馏分进行纯度测试。 PDA/UV条件 检测器： 2998PDA检测器 扫描： 220-300 nm 收集： 单波长220nm 数据管理ChromScope 1.2版 SFC是一种色谱技术，采用压缩CO，作为流动相的主要组分。与气相色谱相比，填充柱和低温提高了柱载样量和化合物的稳定性。简单的多端口阀(用于轻松收集多个峰)和补偿泵简化了馏分收集，无需特殊的捕集设备。 在本应用纪要中，芳樟醇和松油烯-4-醇(图1)用于证明SFC对挥发性风味物质和香味物质的手性纯化能力。首先，通过从(±)-松油烯-4-醇和(±)-芳樟醇标准品中收集对映体进行回收率研究。然后，将这些化合物从薰衣草和茶树精油中进行对映体纯化。重迭进样和快速手性分离缩短了风味物质和香味物质的对映体纯化所需的时间。 图1.松油烯-4-醇和芳樟醇的化学结构、LogP和蒸气压值。 样品描述 使用乙醇制备所有回收和方法开发样品，浓度约为10 mg/mL。回收率样品：通过多组10次100uL重迭进样进行馏分收集，共进样1mL，将收集的所有对映体馏分转移至25mL容量瓶中，并用乙醇定容至刻度，重复三次。对照样品：将1mL(总进样体积)的10 mg/mL溶液用乙醇定容至25mL。由于茶树精油和薰衣草精油中所需化合物的比例相当小，因此这些样品最终需要更高的浓度，分别为50mg/mL和30 mg/mL. (±)-松油烯-4-醇 (±)-芳樟醇 茶树油 薰衣草油 %B(等度) 10 15 8 18 BPR压力 200 Bar 120 Bar 120 Bar 120 Bar 柱温箱温度 35°℃ 35℃ 30C 35C 补偿溶液流速 2 mL/min 2 mL/min 2 mL/min 1.5 mL/min HE温度 35°C 25℃ 30°℃ 25°C 样品浓度 10 mg/mL 10 mg/mL 50 mg/mL 30 mg/mL 进样体积 100 uL 100 uL 100 uL 100 uL 表1.制备型SFC方法条件。 结果与讨论 挥发性风味物质和香味物质的手性纯化本身存在许多挑战。第一个挑战是色谱本身；不仅化合物必须与基质实现非手性分离，而且还需要实现对映体分离。对于纯化而言，良好的色谱分离度能够提高柱上载样量、产物纯度和效率。由于这些化合物具有挥发性和不稳定性，因此必须在不会因蒸发或降解造成显著样品损失的前提下进行分析和纯化。最后，这些化合物的制备需要使用无毒化学物质，对于供人使用或消费的产品则更是如此。 SFC采用CO，作为流动相的主要组分，且在大多数情况下采用醇作为溶剂B。在这种情况下，由于乙醇无毒，与风味和香味分析物以及下游所有纯化后过程均相容，因此可将其用于纯化。此外，由于CO，会在收集后蒸发，因此与传统LC技术相比收集到的溶剂明显更少。SFC用于纯化风味物质和香味物质的另一个优势是，与GC或HPLC相比，分离所用的条件相对温和。低温和无添加剂降低了在分析和纯化期间目标化合物蒸发和降解的可能性。 回收率研究 可在4 min内的等度条件下通过5 um， 10x250 mm CHIRALPAK AD-H柱实现芳香醇和松油烯-4-醇异构体的对映体分离。高分离度和良好的峰形允许每次进样时载样量为1mg。虽然根据这种色谱法可获得更多载样量，但是出于回收研究的目的，目前这种载样量最为理想。等度方法条件能够实现重迭进样，因而对于松油烯-4-醇和芳樟醇手性纯化，可在30min(图2)内进样并收集大约10 mq样品。 图2.(±)-松油烯-4-醇(A和B)和(±)-芳樟醇(C和D)的制备级分离色谱图和重迭收集图。 作为回收率研究的一部分，我们通过测试不同热交换器(HE)的温度来优化回收率。率油烯-4-醇的回收率不受温度影响，并且在35℃HE温度下进行收集。然而，芳樟醇回收率在25℃的较低HE温度下最优。优化条件下的回收率百分比(表中列出了平均产率)和馏分的色谱图显示在图3中。在优化条件下对每种化合物进行三组重迭收集(10次100uL进样)。基于这些化合物的挥发性和通常报道的极低回收率，70%-80%的回收率已较为罕见。此外，回收率研究中的所有馏分均具有>99%的对映体纯度。 图3.(A)(±)-松油烯-4-醇和(A)(±)-芳樟醇对映体纯化产物的色谱图。 精油纯化 为了用实际样品测试纯化技术，分别从茶树精油和薰衣草精油中纯化(R)-和(S)-松油烯-4-醇和(R)-芳樟醇。因此需要通过一些方法开发将对映体从其基质中分离出来，并提高载样量。使用最优的等度方法进行重迭进样，提高收集效率。由于与标准品相比精油中的含量百分比较低，因此为获得目标化合物的可接受产率，需要显著提高载样量。因此，我们制备了更高浓度的样品，茶树油为50mg/mL， 薰衣草油则为30 mg/mL。 图4显示了两种精油纯化的分离和收集结果。将未经稀释的收集馏分直接重新进样；所得的纯度分析显示于图5中。分离出三个目标峰，所得对映体的纯度>99%，总体化学纯度也相当高(>92%)。 图4.茶树油(A和B)和薰衣草油(C和D)中的松油烯-4-醇和芳樟醇的制备级分离色谱图和重迭收集图。 图5.茶树精油和薰衣草精油馏分的化学纯度分析。 结论 Investigator SFC系统采用简化的风味物质和香味物质手性纯化方案，无需在制备型气相色谱中进行复杂的样品捕获。 在30min内纯化约10mg样品，可得到对映体纯度馏分。这提高了制备型气相色谱的效率以及其它纯化技术(如SPE或蒸留)的特异性。 结果表明， 在Investigator SFC系统条件下使用的低温非常适合风味物质和香味物质，从而提高了了收率。 快速等度分离允许在Investigator SFC系统上使用重迭进样，从而获得更高的通量。 实现一步式手性纯化，使目标化合物获得了较高纯度。 使用无毒的CO2：乙醇作为流动相，适合供人使用或消费的样品纯化。 扫一扫，关注沃特世微信 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. ( 参考文献 ) ( 1. Rouhi AM，"Indulging the chem i cal senses"， CSEN， July 14，2003，53-60. ) ( 2. F ranssen MCR， Alessandrini L， Terraneo G，"Biocatalytic production of flavorsand fragrances"，Pure Appl. Chem.， Vol. 77 No. 1 (2005)273-279. ) ( 3. Li L berto E， C agliero C， Sgorbini B， Bicchi C， Sciarrone D， D'Acampora B， Zellner， Mondello L，Rubiolo P，“Enantiomer identification in the flavourand f ragrance fields by “interactive”combination of linar retention indices from enantioselective gas chromatography and mass spectrometry"， J. Chromatogr. A ， 1195(2008)117-126. ) ( 4 . Leffingwell JSD，"C h iral chemistry in flavours 8 fragrances"， SpecialtyChemicals Magazine， March 2011 30-33. ) ( 5 . B E renna E， Fuganti C， Serra S，“Enantioselective perception of chiral odorants"，Tetrahedron： asymmetry， 14(2003)1-42. ) 6.Eyres GT， Urban S， Morrison PD， Marriott PJ，“Application of microscale-preparative multidimensional gas chromatography with nuclear magneticresonance spectroscopy for identification of pure methylnaphthalenes fromcrude oils"， J. Chromatogr. A， 1215(2008)168-176. 通过SFC对挥发性风味物质和香味物质进行手性纯化 1. Investigator SFC系统可实现简化的手性分离，还可用于纯化和回收挥发性化合物，无需制备型气相色谱(GC)中必需的复杂样品捕集。2. SFC比GC具有更高的载样量和更短的运行时间。3. 超临界流体色谱(SFC)使用较低的色谱操作温度，这种温度更适合挥发性和不稳定化合物，可提高风味物质和香味物质纯化中固有的低回收率。4. SFC手性纯化方法使用无毒乙醇和CO2作为流动相，这对于供人使用或消费的化合物纯化而言至关重要。5. Investigator SFC系统可通过使用重迭进样提升采集效率，从而提高通量。