药品中苯磺酸甲酯检测方案(气质联用仪)

智能文字提取功能测试中

2 4表3.线性、检出限及 RSD 数据 (n=6) 烷基磺酸酯和芳基磺酸酯类化合物作为潜在性基因毒性杂质严重威胁人类健康，而其做为药品生产原料使用广泛，因此对于药品中磺酸酯的控制至关重要。本文采用乙酸乙酯提取，通过液体直接进样法分析药品中8种磺酸酯的分析方法开发。 引言 近年来基因毒性杂质成为人们关注的焦点，甲磺酸酯、苯甲磺酸等磺酸类物质与微量的低级醇在合成反应中生成烷基磺酸如甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)、异丙基甲磺酸酯(IMS)、正丁基甲磺酸酯(NBMS)，以及芳基磺酸酯如苯磺酸甲酯(MBS)、苯磺酸乙酯(EBS)、对甲苯磺酸酯(MP-TS)，这些物质可与 DNA 发生烷基化反应，从而可能成为引发癌症的诱因，因此控制药物中该类杂质的毒理学关注主值(TTC)水平非常重要，欧洲医药评价署(EMEA)发布了关于基因毒性杂质的最大摄取量为1.5 ug/d。这些潜在基因毒性的存在引起管理机构的高度重视，为防止奈非那韦事件的发生， EMEA 首先实施详细指南控制杂质限度，美国食品和药物管理局(FDA)随后颁布指南草案，国际药品注册协调会议(ICH)也对基因毒性杂质做出限度规定， 《欧洲药典》增补版7.3明确指出采用衍生化法检测药物中 MMS、EMS、IMS(2.5.38)。 甲磺酸酯基的存在可以使C一0 键之间变的活泼，发生断裂后生成碳正离子而具有烷化作用。基于对此认识，人们开始研究磺酸酯类化合物，希望找到有效的抗肿瘤药物，从中发现了白消安(Busulfan，马利兰)，其结构中含有2个甲磺酸基团，为双功能的烷化剂，可以与 DNA中的鸟嘌呤集合，产生分子内交联，从而使肿瘤细胞死亡。临床上对慢性粒细胞白血病的疗效显著，主要的不良反应为消化道反应及骨髓抑制。 目前因基因毒性物质的概念广泛，所含种类繁多，对于磺酸酯类的物质除去其治癌作用外，其它的性质尚未探知，而其致癌致畸的作用却是不可否认的。对于欧洲药典中采用衍生化法测定 MMS、EMS、IMS，如果某药品中含有甲基、乙基、异丙基类物质，则该方法不可避免的存在其测定局限性，本方法主要提出了一种采用液体直接进样法分析药物中8种磺酸酯的 GCMS方法，方法快速、有效，灵敏度满足对微量分析的要求。 ( 仪器与耗材 ) ( 仪器 ) ( e TraceFinder 3.2 ) ( 。 Thermo Scientific Tr a ce 1310-ISQ， SSL 进 样 口，AS131 0 自动 进样器 ) ( 色谱柱： TG-35MS，30 m， 0.25 mm， 0.25 um P/N： 26094-1420； S/N： 1082682 ) ( ·进样针： 10pL ) 试剂与标准品耗材 HPLC 级乙酸乙酯、甲醇、无水硫酸钠、8种甲基磺酸酯标准品。 仪器方法 进样口温度：250℃；进样模式： splitless， 不分流时间： 1min； 进样体积：1uL，载气：氦气，1.0 mL/min 柱温：50℃(1min)， 10℃ /min 到 280℃ (5min) 离子源：温度280℃， Transfer line ： 280℃ 扫描方式： SIM 模式 方法原理 药品通过乙酸乙酯超声提取，过滤膜后直接上 GCMS 进行定性定量。 溶液配制 标准溶液：0.05g8种磺酸酯于50mL乙酸乙酯定溶制得标准储备液。 标准工作液：取以上标准储备液稀释至0.01 ug/mL、0.02pg/mL、0.05 ug/mL、0.1 ug/mL、0.2 ug/mL、0.5 ug/mL。 样品的前处理 提取： 可溶于有机溶液药品：称取某药品0.05g于试管中，准确加入2mL乙酸乙酯充分振荡，超声提取10 min。 水溶性药品：称取某药品0.05g于试管中，准确加入2mL甲醇：水(5：1)充分振荡，超声提取10min， 再以2mL乙酸乙酯充分超声提取，过无水硫酸钠，以55℃氮吹致尽干，以2mL乙酸乙酯定容。 将以上处理液，过滤膜上 GCMS 分析。 加标样品的制备 将药品研磨制成粉末，称取该药品0.5g， 加入40uL的10pg/mL、250 pg/mL标准稀释液，混均，制得含8种磺酸酯0.8 ug/g、20 pg/g 的加标样品。 结果与讨论 1.色谱柱的选择 磺酸酯类属于极性物质，易溶于水，在水存在下高温条件易发生分解反应，本方法根据极性首先选择极性色谱柱分析。本方法中考察了 Tg-Wax MS 30 m×0.25 um×0.25 mm 和 Tg-35 MS30mx0.25 pm×0.25 mm， Tg-5 MS 30m×0.25 pm×0.25mm三种极性不同的色谱柱。因本方法选择液体直接进样，同时由于药品基质的复杂多样性极易导致较多的杂质进入色谱柱，如果长时间低温下做样会导致色谱柱的污染。另外方法中甲苯磺酸酯类沸点较高，也不易选择极性色谱柱。当选择中等极性、非极性色谱柱时，实验结果表明，选择-5色谱柱分离效果较差，对甲苯磺酸甲酯、乙酯、异丙酯无法完全分离。 2.提取溶剂的选择 磺酸酯为药物生产中的副产物，本方法选择某样品测定，主要考察了乙酸乙酯、甲醇、乙腈、正己烷四种不同的溶剂的提取效率。对于可溶于有机溶剂的药品，当采用甲醇、乙腈做提取溶剂时，对药品中8种磺酸酯的提取效率也较好，由于甲醇、乙腈极性溶剂对色谱柱的损伤大，易导致色谱柱流失，因此本方法采用乙酸乙酯做为提取溶剂。 部分药品为水溶性药品，且其仅在水中溶解性较好，此时针对这些药品，本方法主要采用通过甲醇-水溶液进行提取(5：1)，同时由于甲基磺酸甲酯、苯磺酸乙酯为微溶于水的，若直接以甲醇-水超声提取后过无水硫酸钠，该方法下此两种物质的回收率会受到影响，通过甲醇-水溶液(5：1)提取后，再以2mL的乙酸乙酯进一步超声提取，可以达到更好的提取回收效率。 1.67E7 TIC MS 1t 图1.1 pg/mL8种磺酸酯的 T-SIM 扫描图。 3.标准品色谱图及样品加标色谱 磺酸酯为药物生产中的副产物，本方法的分析目标物及其定性、定量离子如下表1。本方法选择某样品测定，其中未含有8种磺酸酯，且该药品中无其它物质对所分析物质干扰，如下图2为空白、某样品及其加标色谱图。 4.线性、检出限及RSD 配制浓度分别为：10.0、20.0、50.0、100.0、200、500 pg/L的校准溶液，采用上述方法分别进样分析，考察各组分各10.0-500 pg/L 浓度范围内的线性。实验结果表明8种组分在10.0-500.0pg/L线性关系良好，线性相关系数均大于0.995(见表2)。 对某样品添加混合标准溶液(加标浓度为0.8 pg/g、20 pg/g)，考察8种磺酸酯的加标回收情况。实验结果表明各组分的加标回收率均在83.2-99.5%之间，符合日常分析检测的要求。对0.8、20 pg/g 加标水平平行测定6次，平均 RSD 值在4.7-9.3%，符合稳定性要求。同时以三倍信噪比计算各组分检出限，各组分仪器检出限在5.0-12.0 pg/L(见表3)。 本方法能够满足欧洲药典中对甲基磺酸甲酯、乙酯、异丙酯的限量要求，同时对于其它5种磺酸酯也可以做到0.24 ug/g。 表1.分析物保留时间及定性定量离子 编号 化合物 CAS 保留时间 定量离子 定性离子 1 甲基磺酸甲酯 66-27-3 5.81 79 65\80 2 甲基磺酸乙酯 62-50-0 6.87 79 59\97 3 甲基磺酸异丙酯 926-06-7 7.20 123 59\79 4 苯磺酸甲酯 80-18-2 13.72 77 141\172 5 苯磺酸乙酯 515-46-8 14.47 77 141\186 6 对甲苯磺酸甲酯 80-48-8 15.27 91 155\186 7 对甲苯磺酸乙酯 80-40-0 15.96 155 91200 8 对甲苯磺酸异丙酯 2307-69-9 16.07 214 155\172\91 RT： 0.00-16.21 NL： 化合物 线性方程 R² 加标(pg/g)回收率/% 仪器检出限 /pg/L 方法检出限/ug/g RSD /% 0.8 20.0 甲基磺酸甲酯 Y=199269+7825.1X 0.9996 96.5 98.7 5 0.1 7.4 甲基磺酸乙酯 Y=-84075.5+15711.8X 0.9996 94.8 91.5 10 0.2 5.9 甲基磺酸异丙酯 Y=-27662.5+6271.33X 0.9996 93.5 96.4 10 0.2 8.0 苯磺酸甲酯 Y=4418.25+6552.98X 0.9956 88.7 93.2 12 0.24 6.5 苯磺酸乙酯 Y=-96426.9+11213.4X 0.9971 89.0 94.2 10 0.2 4.7 对甲苯磺酸甲酯 Y=75682.9+6650.87X 0.9990 90.5 99.5 12 0.24 7.3 对甲苯磺酸乙酯 Y=-148887+9801.48X 0.9974 94.6 92.7 10 0.2 5.5 对甲苯磺酸异丙酯 Y=-680.967+94.0094X 0.9985 83.2 90.5 10 0.2 9.3 5.方法的优势 在EP的方法中对于甲磺酸甲酯(MMS)、甲磺酸乙酯(EMS)、异丙基甲磺酸酯(IMS)采用衍生化法得到碘甲烷、碘乙烷、碘异丙烷，通过顶空方式进行分析衍生产物来对原药品中MMS、EMS、IMS 的量。此方法存在一定的局限性，当药物中含有易与碘形成碘代烷的其他类型化合物时造成假阳性，如下图，某药品中并未检出甲基磺酸酯，采用EP方法测得其中含中甲基磺酸乙酯(0.8pg/g)、异丙酯(2.6pg/g)，均已超过本方法的定量限，因药品中可能含有某种乙基、异丙基化合物而使其测得结果含有碘乙烷、碘异丙烷。 另外对于EP方法中采用顶空衍生法，其衍生过程需配制 衍生化试剂进行衍生，过程繁多复杂，易造成偏差。本方法采用液体法直接进样法，前处理简单也是此方法的一个优势。 总结 本实验采用赛默飞世尔科技 Trace1300GC 配 ISQ质谱检测器分析药品中的8种基因毒性物质——磺酸酯，样品通过乙酸乙酯超声提取可以完成药品中磺酸酯的萃取。同时对于EP方法中提出的顶空衍生化方法，其本身存在一定的局性限，本方法通过直接进样分析目标物，可以去除假阳性的影响，满足检测要求，本方法准确，灵敏度高。 图3.某同一样品采用EP方法测得其含碘甲烷、碘乙烷(左图)，采用本方法测得其中并未含有甲基磺酸甲酯、甲基磺酸乙酯(右图)。 ( [1]张园园，李银峰，王杰晶乖.药物中痕量黄酸酯类物 质的检测技术研究进展药物评价研究，2012，35 (4)： 304- 208. ) ( [2] Graham E .Taylor， Mark Gosling，Andrea P earce L ow level determination of p-toluensulfonate and b e nzenesulfonate estersin drug substance b y high performan c e liquid chromatograpy/ mass s pectormetry. 2 006，(1119)：231-237 ) ( [3] Roberto A lzaga ， R obert W. R y anb. A generic approach forthe determination o f r e sidues of alkylating agents in ac t ivepharmaceutical ingredients by in situ derivatization-headspace-gas chromatography-mass spectrometry. 2007，(45)： 4 72-479 ) ( [4] Europea n Pharmacopoeia 8.0.2.5.38 ， MMS，EMS an d IM S in active substances ) 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 免费服务热线：8008105118400 6505118(支持手机用户) ThermoFisherSCIENTIFIC AN_C_GCMS-