海参及其制品中海参皂苷检测方案(液相色谱柱)

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海参及其制品中海参皂苷的测定 6-脱氧-D-葡萄糖(喹诺糖) 6-Deoxy-D-gulcose (Quinovose) 【基本信息】 海参皂苷是有羊毛甾烷衍生物和低聚糖组成的三萜皂苷化合物，其中喹诺糖为其稳定的特征性单糖。海参及其制品经乙醇提取、正丁醇萃取得到海参皂苷，再经三氟乙酸水解，水解液中喹诺糖与1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行衍生反应，经C18色谱柱分离， HPLC紫外检测器测定，以喹诺糖含量标示样品中海参皂苷的含量。 【样品的前处理】 萃取：将干海参粉碎至粉末，称取2g，加入40 mL 60%乙醇水溶液，回流提取1h，重复提取3次，合并乙醇提取液于鸡心瓶中，50℃旋转蒸发除去乙醇，提取物用20 mL水溶解，加入20 mL正醇醇，充分震荡，静置分层，吸取上层正丁醇层，按上述方法用正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液于鸡心瓶中，50℃旋转蒸发至干，即得海参皂苷粗提物。 水解：用2 mol/L的三氟乙酸水溶液2 mL 溶解粗提物，转移至水解管中密封，100℃水解2h， 用4 mol/L 氢氧化钠溶液中和至 pH 值为6.5~7.5后转移入具塞试管中，加入1mL三氯甲烷，充分震荡，静置分层，吸弃下层三氯甲烷层，按上述方法重复萃取 3次，将上层水相转移至5 mL容量瓶中，用水定容，即得海参皂苷水解液。 衍生：移取上述海参皂苷水解液与喹诺糖对照溶液 0.5 mL 于2个5mL反应管中，各加入0.5 mL PMP衍生剂溶液与 0.5 mL 0.3 mol/L 氢氧化钠水溶液，混合均匀后，70℃水浴反应 90 min， 取出冷却至室温，各加入0.5mL 0.3mol/L 盐酸水溶液中和。 净化：将上述海参皂苷与喹诺糖标准品的衍生液，加入1mL三氯甲烷，充分震荡，静置分层，吸弃下层三氯甲烷层，按上述方法用三氯甲烷重复萃取3次，将上层水相过0.45 um 滤膜过滤，进样。 空白样品：将PMP衍生剂按上述衍生与净化实验步骤进行。 【分析条件】 仪器： Agilent 1220 色谱柱：TSKgel ODS-100V(4.6mmI.D.×15 cm， 5um) 流动相：磷酸二氢钾-乙腈溶液(pH=5.2) 流速： 1.0 mL/min 柱温： 室温 进样量：20uL 检测器：紫外检测器，250 nm 【分析结果】 图1 空白样品的色谱图 2喹诺糖标准品衍生物的色谱图 图3 干海参中喹诺糖衍生物的色谱图 色谱图序号 峰序号 对照品名称 保留时间(min) 对称因子 理论塔板数 拖尾因子 2 1 喹诺糖衍生物 39.899 0.99 10497 1.01 3 1 喹诺糖衍生物 40.215 1.02 10664 1.00 结论 TSKgel ODS-100V(4.6mmI.D.×15 cm，5um)可以将海参皂苷水解后的各单糖衍生物分离，且对喹诺糖衍生物有较高的理论塔板数，峰型对称，符合国家标准 GB/T 33108-2016中的要求。 本实验中采用的TSKgel ODS-100V（4.6 mmIDX15cm,5um)反相色谱柱，可以将海参皂苷水解后的各单糖衍生物分离，且对喹诺糖衍生物有较高的理论塔板数，峰型对称，完全符合国家标准GB/T 33108-2016海参及其制品中海参皂苷的测定的要求。