液相色谱中系统性筛选策略检测方案(工作站及软件)

智能文字提取功能测试中

「白皮书]WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「白皮书] Paula Hong 和 Patricia McConville 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 简介 分析实验室可采用多种策略进行反相液相色谱(RPLC)的方法开发。很多实验室都采用每次评估一个因子的方法开发途径。但是，这种方法采用以结果为导向向分步式方案，需要耗费大量时间。虽然实施起来非常简便，但由于探索的实验空间有限，通过这种方式我们通常难以获得稳定耐用的方法。还有一些实验室采用基于统计数据且符合质量源于设计(QbD)原则12的方法进行方法开发。QbD的实验基于统计学原理设计，应用被称为“试验设计”(DOE)的方法学同时探索多个变量，因此是一种更为全面的方法。这种方法可能需要使用专门的软件平台进行数据评估。因此，此类方法还可能涉及其它投资以及针对分析人员的培训。还有第三种被许多实验室采纳的方法一系统方法开发，该方法由预定义的实验设置和有序的方案组成3-5。系统方法开发是一个可控过程，筛选数据在单一运行中被采集和分析。 已有许多文献对系统方法开发的方式进行了详细的报道和说明6，这些方法大都相当依赖仪器的分析效率以及色谱数据系统(CDS)。 方法开发仪器制造商已致力于提高液相色谱仪器和检测的易用性、稳定性和通用性。例如，借助最新型的仪器，分析人员现在已经能够为涉及多个变量(色谱柱和流动相)的条件筛查分析设置无人值守式操作。 UltraPerformance LCTM(UPLCTM)与低扩散系统和检测器相结合能是提高分离能力。该系统采用了ACQUITYTM QDaTM质谱检测器等先进的检测技术，。F可通过多重检测追踪色谱峰和检测共洗脱物质。此外，数据采集软件还能够通过自定义功能(例如数据报告、处理和解析功能)为用户提供更多信息。 本白皮书介绍了一套协同性的系统方案，方案采用UPLC仪器、亚2um填料的色谱柱以及EmpowerTM 3软件，为用户提供了一套精简的方法开发方案。该系统方案采用ACQUITY UPLCH-Class PLUS 系统和ACQUITYQDa普谱检测器， 其中ACQUITY UPLCH-Class系统配备了带有溶剂选择阀、色谱柱管理器和低扩散检测器(例如ACQUITY UPLC PDA检测器)的四元泵。将该系统与亚2pm色谱柱和Empower 3软件相结合，是研究人员针对多种化合物进行系统方法开发的一种有效途径。 概述 色谱方法开发对于分析化学家而言意味着相当多的时间投入。如果方法开发工作流程能够将影响色谱分离效果的各种化学和物理因素都考虑在内，将极大提升分析人员开发可靠分离方法的能力。将上述考虑因素纳入一个清晰的导向策略中，能够最大限度降低重复或循环测试对方法开发速度的影响，同时也为分析人员提供了一套条理清晰的简化方法开发方案。 系统方法开发的工作流程遵循一系列步骤进行，并且每个步骤都有明确的目标。图1所示为系统方案的各个步骤，同时也展示了方法条件、色谱柱、流动相以及其它变量。每个步骤的设计目标都是为分析人员提供他们所需的信息，确保所有可能影响分离选择性和分离度的关键参数都能得到评估，其最终目的是通过系统方案开发出稳定的分析方法。 要实现上述目标，我们必须考虑色谱分离的原理。如下面的分离度基本方程所示，柱效、选择性和保留因子会影响两个峰的分离度，而它们对分离度的影响程度又各不相同。 因此，要改善分离度，我们必须充分利用化学因素(保留因子和选择性)并提高柱效。前者需要我们利用经过优化的仪器和固定相实现最高柱效和低扩散性，而后者通过采用优先考虑上述参数的系统方案即可有效实现。 第1步：定义标准 方法开发过程需要一系列预定义标准和目标。这些目标涉及很多方面且各不相同，包括灵敏度和线性、通量和周转时间、样品前处理、成本、方法的可转换性、对操作人员的技术要求等等。其它目标还包括分析方法的适应性标准(USP分离度和USP拖尾因子)或总的色谱峰数量等其它因子。采用能够评估这些目标和标准并自动生成相应数值的CDS，能够显著缩短数据处理和评估所需的时间。 图1.系统方法开发工作流程的步骤和条件。 第2步：定义系统并验证其性能 方法开发的工作量非常大。通常仪器和CDS的选择会影响开发过程或后续的方法转换。使用与分析人员采用的工作流程不兼容的仪器会使方法开发过程变得更加繁琐。缺乏适当的维护则会导致仪器停机，降低实验室工作效率。因此，采用带有四元溶剂管理器且能够控制多根色谱柱的UPLC系统有助于分析人员探索更宽泛的选择性范围。UPLC系统的低扩散流路及其能够对色谱柱洗脱液进行快速采样的检测器还能提供柱效优势，此外，自动化系统检定测试方案以及用于系统性能验证的质量控制标准品可带来效率优势。进样器的选择同样会影响方法开发。利用Flow-Through-Needle进样器(例如ACQUITYUPLCH-Class 样品管理器FTN-H)， 整个梯度的流动相都能流经进样针和样品定量环。这样一来，全部样品都能被转移到色谱柱中，从而降低发生残留的可能性。 Flow-Through-Needle的设计让分析人员能够灵活选择进样体积，无需重新配置进样器。 规格表中列出的ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统的进样体积上限为1.0mL(采用可选的扩充定量环和注射器)。这使得方法开发人员能够根据需要快速改变色谱柱的上样量，以便研究方法的灵敏度或色谱柱配置的更改。 除溶剂和样品传输系统外，我们还必须仔细考量要选用的检测技术。仅采用单一的检测技术可能不足以获得能确保检出所有样品组分的全部信息。此外，单一检测技术也可能无法鉴定不均匀的峰或共洗脱峰，或者无法为新组分/未知组分的鉴定以及峰追踪提供有价值的信息。在常规分析中应用正交检测器(例如紫外检测器和质谱检测器)可极大地确保所有样品组分均得到检测和分离。质谱检测器(例如ACQUITY QDa质谱检测器)的应用有助于我们执行此类方法开发，而且降低了使用单独标准品验证分析物保留时间的需求。其它可用的检测技术(蒸发光散射检测器、荧光检测器等)也为我们检测多种组分提供了丰富的选项。 另一个重要的考虑因素是CDS。 Empower 3软件这样的CDS可提供方法开发所需的多种重要工具，包括仪器控制、进样排序和功能协调工具等。 此外， Empower 3软件还能在合规环境下利用关系型数据库对数据进行编目、存储、检索和保护。利用自定义或用户创建的计算以及输入字段还可实现其它功能，例如用户可使用查看过滤器整理数据，或者利用批处理和报告功能简化数据分析过程。Empower 3软件将这些功能相结合，可根据方法适应性标准为用户提供简单的测定结果，帮助其评估每次分离的效果。此外，该软件还提供可同时查看质谱和紫外检测信息的单独窗 口，简化了数据评估过程。 多种新型仪器、色谱柱和软件的各项特性和功能的结合，让分析人员能够选出最佳的系统，实现高品质且高效的方法开发(表1)，自动化的软件和硬件则能够简化方法开发过程。 表1.系统方法开发采用的系统和条件。 方法开发的时间和资源投入巨大。我们需要对评估后的系统进行测试，以确保其运行符合性能标准。进行评估时，我们应采用一组已知的组分或质量控制标准品(QCRM)，优选其中所含的分析物能够在梯度范围内洗脱并且能够验证色谱柱和系统性能的标准品。如此一来，当保留时间或峰形发生变化时，我们就能将此时得到的色谱图作为系统或色谱柱中存在理化异常的证据。 如图2所示，我们在配备ACQUITY QDa质谱检测器的ACQUITYUPLC H-Class PLUS系统上测试了ACQUITY QDa QCRM标准品(部件号186007345)，以评估系统和色谱柱的性能。相较于之前所进行的分析，得到的紫外和提取离子色谱图。 图2.利用检查标准品验证系统性能，确保仪器运行正常，让分析人员对所得结果更有信心。本例中出现的灵敏度损失以及检查标准品峰宽的增加是系统渗漏导致的。 (XIC)符合预期的保留时间和峰形要求。而在之后的检查(或基准检查)中，我们发现色谱峰变宽、系统灵敏度下降并且系统压力降低(如图2下方的色谱图所示)。故障排除检查表明这是色谱柱连接不当或渗漏造成的。作为参比标准品使用的检查样品是我们进行方法开发之前对系统性能进行基准检查的工具。 第3步：快速探索 高效的方法开发方案可减少重复实验的次数。这些方案专为在开发过程的各步骤中获取信息量丰富的有用数据进行了结构化设计。在此，我们将介绍方法开发方案中采用高pH和低pH条件进行的初始快速探索步骤。该步骤可为简化方法开发过程提供重要信息。已有报道指出，利用高pH的流动相能够显著影响反相LC(RP-LC)的选择性。在高pH下的运行是通过在高pH下可保持稳定的色谱柱填料实现的。利用这种附加工具，我们能够使用同一根色色柱分别在高pH和低pH条件下分析单个样品。 流动相pH的影响 在RP-LC中，分析物的保留是通过分析物、固定相和流动相之间的相互作用实现的。分离结果则取决于样品在疏水性(非极性)的固定相与亲水性(极性较大)的流动相之间的分配。当化合物的离子化状态改变时，化合物在非极性固定相与极性流动相之间的分配情况也将发生变化，进而影响保留时间。 例如，在低pH(<3)条件下，处于完全未电离状态的弱酸与非极性固定相之间的相互作用将增强，从而提升其保留性能(图3)。而在高pH(>8)条件下，碱性化合物也处于同样状态，因此可实现更好的保留性能。在中间pH范围内，许多酸和碱都处于部分带电的状态，保留性能变化不明显。因此，我们可通过在高pH和低pH条件下进行的分析来判断样品中是否含有会在高pH或低pH条件下影响分析物保留性能的酸和/或碱。 在进行该组实验时还可将样品分为五大类(强酸、弱酸、碱和中性物质)，以便定义后续的实验。如果在高pH或低pH条件下均观察不到分析物的保留，那么分析物很有可能是是酸或或碱，这类物质很难在反相色谱中实现保留，因此我们可能需要考虑使用其它方法。此时可考虑向流动相或样品稀释液中加入离子对试剂，此外，亲水作用色谱(HILIC)也能为极性分析物提供更好的保留性能和预期的分离效果910。如果在高pH和低pH下均获得了足够的保留性能，但选择性不同，那么这两种条件都需要进行后续评估。如果在高pH和低pH下均获得了足够的保留性能且两种条件下的选择性没有差异，那么样品中可能不含弱酸和弱碱性物质，在后续开发中可不必控制pH。 图3.用于说明pH影响的反相保留图。可离子化的分析物在其处于非离子化状态时的保留性能最佳。中性物质不会发生电离，因此不受pH影响。 pH快速探索时的色谱柱选择 要在高pH和低pH下进行筛查，固定相必须能够兼容流动相条件。由于硅胶颗粒在高pH下会发生溶解，因此硅胶型固定相在高pH(>8)下的化学稳定性较差"。 杂化颗粒更不易受到上述因素的影响，适合与高pH流动相配合使用7。此类颗粒的表面硅醇基密度比硅胶颗粒更低，这会导致选择性和峰形出现差异。为进一步改善碱性化合物的峰形，可使BEH碱性颗粒的表面带上正电荷12。施加到颗粒(CSHTM)表面的正电荷可改善低离子强度的酸性条件下(0.1%甲酸)碱性化合物的峰形，因此该填料非常适用于在高pH和低pH下进行快速探索。 有助于快速探索的仪器 除色谱柱外，选择合适的仪器配置也有助于快速探索步骤的执行。ACQUITY UPLC H-Class PLUS系统的四泵泵可实现高pH和低pH流动相的无人值守式筛查。这种名为Auto▪Blend的技术可提供三元或四元混合功能，能够通过混合储备液制备所需的流动相。 例如，只需改动流动相中酸或碱的比例或含量即可改变pH。执行快速探索步骤时，使用四瓶溶剂即可对低pH和高pH流动相进行筛查，从而顺利完成快速探索步骤，这些溶剂分别是：酸储备液(125mM甲酸)、碱储备液(125mM氢氧化铵)、水和乙腈(图4)。 API及相关化合物的快速探索 我们将这些因素结合到方案之中，对活性药物成分(API)昂丹司琼及其相关化合物的分析方法进行了快速探索(图5)。结果表明高pH和低pH条件下的分析存在保留性能和选择性的差异。在低pH条件下，所有分析物均成功实现了分离，而在高pH条件下，碱性物质(1、2和3)的保留时间发生了明显偏移(整体偏移)。尽管高pH条件下的洗脱顺序发生了变化，但碱性物质之间的洗脱时间间隔大体上仍保持一致，这表明这些分析物对大幅度pH变化的响应各不相同。因此，对于这些分析物，在研究分析的pH范围时，即使小幅度的增量也可能导致选择性差异。 图4. Auto·BlendTM的四元混合功能可按不同比例混合储备缓冲液和纯溶剂，从而实现流动相的自动化配制。 图5.昂丹司琼及相关杂质的快速探索，目的是确定后续测定的适用条件。采用低pH流动相进行分析时获得的分离度更高。采用精简的软件可根据适用标准对分析运行进行评分。 CDS提供多种可帮助分析人员进行数据评估的工具。在上面的例子中，利用每个峰的质量数标记(在峰顶点处标注强度最大的离子)能够更轻松地进行峰追踪(图5)。此外，可同时显示色谱和光谱视图的单个窗口(图6)也简化了多数据流分析。窗口下部显示的色谱图包括分离所得的UV色谱图、总离子流色谱图(TIC)和提取离子色谱图(XIC)。自动生成的XIC由各积分UV峰TIC的提取基峰离子组成。各峰的光谱数据显示于屏幕上部，内容包括UV光谱和质谱信息。此时，质谱、UV色谱图和光谱信息将同时显示，帮助分析人员追踪峰和确定共洗脱物。 CDS还可以帮助分析人员确定是否存在共洗脱峰。 如高pH条件下橙提取物的快速探索结果所示(图7)，峰3的峰形不对称，表明有两种分析物未完全分离。分析人员可通过评估峰前沿、顶点和后沿部分的光谱信息做进一步的分析(如插图所示)。具体而言，单个峰不同区段的UV光谱和质谱可帮助分析人员判断峰纯度以及是否存在共洗脱物。谱图中峰3的评估结果表明，在峰顶点、前沿和后沿部分，最主要的离子(m/z403.1和343.0)所占的比例各不相同。该视图(纯度视图)表明样品中存在两种分析物，而非单一组分，因此还需做进一步的分析。分析人员可通过综合视图进行峰追踪并获取峰纯度信息。 图6.CDS可同时显示质谱图和紫外光谱图，为分析人员提供峰追踪和确定共洗脱物所需的信息。 完成探索结果的评估后，我们可能还需要进一步地实施方法开发，目的是提高分离度、改善选择性、修正较差的峰形或者解决其它重要问题以精炼方法。 因此，分析人员可采用选择性各异的色谱柱和强溶剂进行更全面的筛查。由分离度方程可知，选择性、柱效和保留性能都会影响分离度。选用不同的色谱柱同样也会影响这些参数。例如，选用亚2 um颗粒的色谱柱可提高分离效率。然而，改善分离度最有效的方法是改变分离的选择性，具体方法是使用含不同配体和基础颗粒的固定相来扩大选择性范围。 例如，采用亚乙基桥杂化(BEH Technology")颗粒或高强度硅胶(HSS)颗粒可改善选择性，后者具有比典型大孔径硅胶色谱柱更加出色的机械稳定性13。 除了基础颗粒之外，固定相也会影响分离的选择性。已有大量研究表明，利用苯基色谱柱的TT-TT相互作用或使用内嵌极性固定相能够较为显著地改善分离选择性。所选用的固定相还必须与实验所用的流动相、pH和温度兼容。 考虑到以上这些因素，筛查步骤应选用在低pH和高pH条件下均具有较宽选择性范围的色谱柱(图1)。 图7.橙提取物的快速探索结果。分析人员可通过峰纯度视图获取有关峰纯度和可能存在的共洗脱物的相关信息。本例中，我们在高pH下橙提取物的快速探索结果中发现了两种未完全分离的分析物。由质谱分析窗口中的峰纯度视图可以看出，在峰前沿、顶点和后沿部分， m/z 403.1和343.0两种离子所占的比率不同，这表明存在两种未分离的分析物。 图8.以橙提取物样品的初始方法探索结果(图7)为依据，继续执行步骤2或筛查步骤。该步骤采用了四种色谱柱和两种强极性溶剂，在低pH下进行。突出显示的色谱图为选出的最佳条件(见图9)。 有利于筛查步骤的仪器 要实现多根色谱柱的无人值守式筛查，分析人员应考虑使用色谱柱管理器。多色谱柱管理器(例如ACQUITY UPLC H-ClassPLUS 系统的配置)能够通过集成式阀独立切换色谱柱。此外，它还能独立控制每根色谱柱的温度，让用户能够灵活选择各种色谱柱填料，不受操作规范的限制。能够容纳多根色谱柱的色谱柱室能为分析人员提供足够的操作灵活性，使其无需在分析之间手动切换色谱柱。 在筛查步骤中，我们还可以通过改变所用的强溶剂来调节选择性。配有溶剂选择阀的四元泵可在在pH和高pH条件下进行无人值守式筛查以及强溶剂的混合。将多根色谱柱与质子和非质子强溶剂(分别为甲醇和乙腈)相结合，我们可评估非常宽泛的选择性范围。 色谱柱和强溶剂的筛查 为了说明该筛查方案，我们对橙提取物中的黄酮类化合物进行了评估。需要注意的是，由于筛查步骤是快速探索步骤的延伸，为了避免重复，仅需使用甲醇作为强溶剂对CSH C.色谱柱进行评估。该组化合物在低pH和高pH下所得的探索结果(图7)表明，其选择性和保留性能变化极小，因此这类化合物为中性或弱酸性。我们为筛查步骤选择了关键分析物对分离度更高的低pH条件。 使用不同的色谱柱和强溶剂得到的保留性能和选择性差异极大(图8)。使用甲醇时，分析物在所有色谱柱上的保留性能都优于使用乙腈时的保留性能。原因是可与溶质发生极性-极性相互作用的甲醇在反相体系中是一种弱溶剂。两种C固定相所得的分离结果类似，但采用表面多孔颗粒(CORTECS C，+色谱柱)时，柱效和关键分析物对的分离度稍微高一些。苯己基固定相可同时发生TT-TT相互作用和烷基链相互作用，因此对于这组分析物而言， CSH苯己基色谱柱的选择性与BEHC，固定相类似，但其保留性能较差。最后，可与路易斯碱发生TT-T相互作用的五氟苯基固定相(HSSPFP)色谱柱常用于分离难以保留的碱性化合物。本例中，PFP与中性和酸性溶质相互作用，从而提升了保留性能；但由于其选择性较差，导致整体分离度下降。 SCORINGREPORT 上mpower.r3 Sample Set ID： 1954，8451，9465，8828，8387 Run Time： 7.5 MinutesSOFTWARE Result Set ID： 6388 Injection Volume： 5.00 ulProcessed Channel Descr.： PDA 315.0 nm (200-500)nm， PDA 260.0 nm (200-500)nm Injection ld Column StrongSolvent pH TotalPeaks Total PeaksRs >=2.0 Total Peaks Tailing <=1.5 LowestRs Mink* RTofLast Peak 1 8526 CORTECS C18+ ACN Low pH 6 5 6 2.27 9.69 3.66 2 8407 CSH C18 ACN Low pH 6 4 4 0.45 9.78 3.66 3 8610 CSH PH MeOH Low pH 6 3 4 2.23 13.77 4.86 4 8440 CSH C18 ACN High pH 6 2 4 1.50 9.77 3.66 5 8673 CORTECS C18+ MeOH Low pH 5 4 5 2.19 13.85 4.96 6 8741 CSH C18 MeOH Low pH 5 3 5 1.94 13.18 4.73 7 2084 CSH PH ACN Low pH 5 1 0.82 9.74 3.41 8 9486 HSS PFP MeOH Low pH 4 0 0.31 16.03 5.23 9 8871 HSS PFP ACN Low pH 4 0 2 1.51 10.93 3.77 第5步：优化 必要时，除pH、色谱柱和溶剂筛查之外，我们在优化色谱分离条件时通常还需要进行其它的分析。但在这种情况下，相关分析的实验设计应根据具体的方法要求而异。方法开发的目的包括分离的彻底性、峰鉴定结果可靠性、分析的灵敏度和定量性能。其它要求还包括分离度、峰纯度、分析时间或拖尾因子等分离标准。要实现上述目标，我们可以通过多种途径来优化方法，包括优化柱温、色谱柱规格、流速、pH、梯度斜率和梯度时间等。 图10.自动化的仪器控制软件可利用Auto-Blend Plus将流动相的pH变化直接编入梯度表。特定pH所对应的酸碱比例根据经验表或酸/碱组合的pKa确定。。“Salt”列是为有机溶剂或强溶剂设置的，该列示数为百分比数值乘以10(50mM=5%)。 使用Auto-Blend Plus优化流动相pH 上述许多变量都能非常简单地进行操控，但要评估流动相pH的细微变化所产生的影响却有一定难度。制备不同pH水平的多种流动相是一项极其繁琐且耗时的工作。但流动相pH的细微变化却能够显著影响分析的选择性、保留性能和灵敏度，对于部分带电的分析物的影响更是尤其明显(图3)。因此，要开发出稳定的方法，我们必须评评流动相pH。 图11.流动相pH对昂丹司琼(峰5)及相关杂质分离的影响。流动相pH变化会导致分离体系对此类化合物的保留性能和选择性发生改变。本例中， pH变化1个单位之后，致使峰2的保留时间发生了0.4 min的变化，成为最晚洗脱的峰。 借助ACQUITY UPLC H-Class PLUS 系统的Auto·Blend PlusTM功能，分析人员可通过专门设计的软件来设置控制pH的方法(图10)。这种控制pH的方法非常灵活，它能为分析人员提供满足样品和方法要求的任何缓冲液，或者制制出pH范围更宽的混合缓冲液。系统按照用户设定的值，采用经验表表酸/碱组合的pKa确定酸碱比率。该计算功能让分析人员能够对pH的细微变化进行无人值守式的评估，这对于方法开发而言是极为有用的工具，尤其适用于可电离化合物。 图11是利用Auto·Blend Plus评估昂丹司琼及其相关杂质的分离所得的结果。如前所述(请参阅“快速探索”部分)， pH大幅改变时，碱性物质的保留性能和选择性发生了变化。 因此我们推测，如果探索较小幅度的pH增量变化，也会出现较大的选择性差异。而在实际研究中我们发现，使用Auto·BlendPlus改变1个pH单位(将pH9改为10)就会显著影响选择性。峰2(m/z257.1)的选择性从第二洗脱峰变为了最晚洗脱峰。本例说明了pH发生1个单位的改变时，保留性能和选择性可能受到的影响。此外，使用纯溶剂和浓缩储备液在线生成流动相也减少了制备过程中的测定操作。 评估最终分离方法的优化结果 除pH之外，分析人员还可以探索多个变量(温度、梯度、流速等)。分析人员可利用CDS中的工具评估这些变量对分离产生的影响。如前所述，完成数据处理后，分析人员可自定义报告的自动生成方式，使其着重报告关键参数。 图12所示为分离橙提取物中黄酮类化合物的条件优化报告。本例中，我们要达到的目标包括完全分离黄酮类化合物、使所有峰的USP分离度大于2.0，以及使所有分析物的保留时间在3.0min以内。我们采用了各种柱温和梯度斜率(未示出)分析样品，以评估分离条件。最后调节了分离的运行时间(如图12的报告所示)。最终确定的条件为：柱温35℃，梯度斜率为单位色谱柱体积改变2.3%B； 运行时间5 min。 为确保所有黄酮类化合物实现完全分离，我们通过UV谱图和质谱图评估了分离所得的每个峰，通过比较峰前沿、顶点和后沿部分的UV谱图和质谱图(图13a)确定了峰纯度。结果表明峰不同部位的离子组成相同，且具有相同的UV谱图。我们还利用Empower 3软件的PDA峰纯度算法确证了峰纯度(图13b)。 如采用最终方法所得的峰3所示，在PDA峰纯度分析结果中，纯度角(绿色线条)低于纯度阈值(蓝色线条)，指示出了峰的纯度。至此，样品方法开发步骤全部完成。 图12.橙提取物中黄酮类化合物分离条件的优化报告。分析人员可借助灵活的报告功能为目标分离条件选择变量和标准。 结论 方法开发通常需要大量人力和仪器资源。精心挑选可协同工作的分析系统(包括色谱柱、仪器、软件和流动相)可实现精简、自动化的方法开发过程，以下工具可供方法开发人员选用： ■低扩散系统，用于提高通量、改善分离度以及灵敏度 自动化系统，用于筛查多种色谱柱、流动相和温度条件 m四元混合系统，用于混合储备缓冲液以及直接按照pH单位调节pH Flow-Through-Needle自动进样器，用于减少残留并确保所有样品均到达色谱柱 ■仅使用同一色谱柱即可执行高pH和低pH筛查的色谱柱固定相各种检测器，用于确保样品得到全面表征以及共洗脱物的 图13. Empower 3软件的峰纯度视图。橙提取物(峰2)的优化分离结果。(a)质谱分析窗口中同时显示峰2的质谱和UV光谱数据的视图。通过该视图可比较峰的前沿、顶点和后沿部分，以判断峰的纯度。(b)最大图的PDA峰纯度视图，用于通过UV谱图判断峰纯度。 能够自动进行峰检测、数据分析和报告的数据采集和处理软件平台，这些功能有助于分析人员轻松评估数据质量 ■可自定义的CDS计算和报告功能，有助于评估样品和分离标准 完善的系统解决方案能够为分析化学家提供必要的工具，帮助他们开发出更加稳定、可靠且可重现的分离方法。按照这样的方案进行方法开发，能够逐步提高方法的可靠性，确保方法得到一致、准确的结果，同时提高方法验证的成功率16。 ( 参考文献 ) ( 1 . S chmidt AH， Molnar l. U sing an innovative Quality-by-Design approach for development of a stability indicating UHPLCmethod for ebastine in the APl and pharmaceutical formulations.J Pharm Biomed Anal. 2013 May5；78-79：65-74. doi：10.1016/j.jpba.2013.01.032. ) ( 2. D C ebrus B， Guillarme D， Rudaz S. Improved quality-by-designcompliant methodology for method development in reversed- phase liquid chromatography.J Pharm Biomed Anal. 2013 Oct； 84：215-23.doi：10.1016/j.jpba.2013.06.013. ) 3. Snyder LR， Kirkland JJ， Glajch JL. Systematic Approach to theReversed-Phase Separation of Regular Samples. Practical HPLCMethod Development； John Wiley & Sons， Inc.： 1997； pp 402-38. 4. Stafford JD， Maloney TD， Myers DP， Cintron JM， Castle BC. Asystematic approach to development of liquid chromatographicimpurity methods for pharmaceutical analysis. J Pharm BiomedAnal. 2011 Sep 10；56(2)：280-92. doi：10.1016/j.jpba.2011.05.028. 5. Maziarz M， McCarthy SM， and Wrona M. Improving Effectivenessin Method Development by Using a Systematic ScreeningProtocol for a USP Method (Metocloproamide HCI and RelatedSubstances). Waters Application Note 720005026EN.2014. 6. Schoenmakers P. Practical HPLC method development ： byL.R. Snyder，J.L. Glajch and J.J. Kirkland， Wiley， Chichester， NewYork， 1988，XVI+260 pp.，ISBN 0-471-62782-8.JChromatogr A.1990；509(2)：406-7.doi：10.1016/S0021-9673(01)93100-0. 7.WVyndham KDW， T.H，Iraneta， P.C， Neue， U.D，McDonald，P.D，Morrison， D， Baynham， M. A Review of Waters Hybrid ParticleTechnology： Ethylene-Bridged [BEH Technology] Hybridsand Their Use in Liquid Chromatography. Waters White Paper720001159EN.2004. 8. Neue UD，O'Gara JE， Mendez A. Selectivity in reversed-phaseseparations： Influence of the stationary phase.J Chromatogr A.2006 Sep 15；1127(1-2)：161-74. 扫一扫，关注沃特世微信 THE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE，" Waters、 The Science of What’s Possible、UltraPerformance LC、UPLC、ACQUITY、QDa、UPC2、Empower、Auto-Blend、BEH Technology、Auto·Blend Plus、 CSH和CORTECS是沃特世公司的商标。其它所有商标均归各自的拥有者所有。 9. Alpert AJ. Hydrophilic-interaction chromatography for theseparation of peptides， nucleic acids and other polar compounds.J Chromatogr. 1990 Jan 19；499：177-96. 10. Dejaegher B， Mangelings D， Vander Heyden Y. Methoddevelopment for HILIC assays. J Sep Sci. 2008 May；31(9)：1438-48.doi： 10.1002/jssc.200700680. 11. Kirkland JJ， van Straten MA， Claessens HA. High pH mobile phaseeffects on silica-based reversed-phase high-performance liquidchromatographic columns. J Chromatogr A. 1995 Feb 3；691：3-19.doi： 10.1016/0021-9673(94)00631-I. 12. Iraneta PC，Wyndham KD， McCabe DR， Walter TH. ChargedSurface Hybrid (CSH)Technology and Its Use in LiquidChromatography. Waters White Paper 720003929EN.2011. 13. McDonald PD，McCabe DR，Alden BA， Lawrence N，WalshDP，Iraneta PC， Grumbach E， Xia F， Hong P. Topics in LiquidChromatography： Part 1. Designing a Reveresed-PhaseColumn for Polar Compound Retention. Waters White Paper720001889EN.2007. 14. McCarthy SM. Improving Decision Making during MethodDevelopment Using Empower 3 CDS Software. WatersTechnology Brief 720004978EN.2014. 15. Jones ML， Lefebvre P， Plumb R. Utilization of UPLC and Empower2 CDS for Efficient Method Development of an Impurity Profileof Simvastatin and Related Impurities. Waters Application Note720002185EN.2014. 16. Summers MF and Fountain KJ. Validation of a Method for theSeparation of Ziprasidone and Its Degradants using Empower 2with Method Validation Manager (MVM). Waters Application Note720004077EN.2011. 在液相色谱方法开发中实施系统性筛选策略的全面解决方案 本白皮书介绍了一套协同性的系统方案，方案采用UPLC仪器、亚2μm填料的色谱柱以及Empower3软件，为用户提供了一套精简的方法开发方案。该系统方案采用ACQUITY UPLC H-Class PLUS 系统和ACQUITY QDa质谱检测器，其中ACQUITY UPLC H-Class系统配备了带有溶剂选择阀、色谱柱管理器和低扩散检测器(例如ACQUITY UPLC PDA检测器)的四元泵。将该系统与亚2μm色谱柱和Empower3软件相结合，是研究人员针对多种化合物进行系统方法开发的一种有效途径。