城市污水中痕量的非法药物和处方药检测方案(液相色谱仪)

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大体积进样 (LVI)—-液相色谱-串联质谱用于城市污水中痕量的非法药物和处方药的分析 ● 应用简报环境 作者 摘要 Syam S. Andra Jennifer A. Field 环境和分子毒理学系 美国俄勒冈州立大学科瓦利斯， OR 97331 美国 安捷伦新型自动进样器被用于升级安捷伦系列的高效液相色谱，以替代离线或在线固相萃取进行样品富集。使用连接在液相色谱的1800 pL的大体积 (LVI) 进样环和串联四极杆液质联用仪，检测城市污水(原进水)中一些非法药物和它们的代谢物。本应用简报描述的方法使用了 ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱，并具有优异的线性(9 pg到450ng)。在不降低灵敏度的前提下，该方法具有优异的精确度、回收率和精密度 。 Agilent Technologies 污水监测作为鉴别药物滥用情况并且成本效率很高的工具，正在受到广泛关注[1]。研究人员在原水、经过污水处理厂处理过的废水 (WWTP)、饮用水和乐场所的水中发现了一定数量的非法和/或处方药物。由于这些化合物在这些基质中的浓度很低，现在的分析方法法括样品前处理和富集技术， 如固相萃取 (SPE)。然而，固相萃取 (SPE)的主要缺点是：费时、耗力、以及需要从50 到1000mL的大体积样品。尽管具有很好的样品净化和富集效率，但是由于低的进样体积和固相萃取材料的污染，固相萃取(SPE) 也存在明显缺点，即待测物的低富集效率和较差的回收率精密度[2]。 本应用简报介绍了大体积(LVI)进样和液相色谱-串联质谱用于分析污水中的微量药物，包括处方药和街头毒品。 与传统的进样体积(5-20pL)相比，大体积进样(LVI)的直接进样体积可达2000pL或更高。大体积进样(LVI)的原理是，在低洗脱强度流动相时，大体积进样装置将待测物富集到分析柱的柱头进行分析。盐和其它没有分配到固定相的基质组分则直接穿过色谱柱。与固相萃取相似，待测物在分析柱上被浓缩之后，随着流动相的洗脱强度的增加，被富集的待测物被洗脱并被分离。大体积进样(LVI)的主要优点包括：提高了灵敏度、精确度和精密度，减少了样品体积(如2mL)。大体积进样方法非常可靠，适合有机污染物的常规检测，如城市污水中的含氟化合物[2、3]、违禁药物和相关的物质[4]。 通过对加标实验的基体效应研究、结果准确度和精密度的检测，优化与评价了大体积进样(LVI)方法。用这些优化条件测定仪器和方法的检测限和定量限。最后，在特定社区内，使用该分析方法对特定污水处理理 (WWTP)中收集到的24小时平均组成的污水进行分析，以便测定非法药物和它们的代谢物水平。本研究中的九个待测物的结构如图1所示。 图1.研究涉及的化合物结构 ( 实验 ) 试剂 试剂齐的冰醋酸， EMD 化学品 (Gibbstown， NJ， USA)。 液相色谱纯的乙腈和甲醇， Fisher Scientific (Fair Lawn， NJ，USA). 标准品 标准品(分析纯>99%，溶于甲醇或乙腈，浓度1mg/ml)， 购自 Cerilliant (德克萨斯州 Round Rock)，包括： 1. (±)甲基苯丙胺，(±)3，4-亚甲二氧基-甲基苯丙胺(MDMA)，苯环己哌啶 2. 可卡因，苯甲酰芽子碱 3. (±)-美沙酮，氢可酮，羟考酮 4. 尼古丁 同位素标准品(分析纯>99%，溶于甲醇或乙腈，浓度100 pg /ml)， 购自 Cerilliant (德克萨斯州 Round Rock)，包括： 1. 甲基苯丙丙-Dg，，((±)3，4-亚甲二氧基-甲基苯丙胺-D((±) MDMA-Dg)，苯环己哌啶-D， 2. 可卡因-D，苯甲酰芽子碱-D(±) 3. 美沙酮-Dg，氢可酮-Dg，羟考酒-D 4. 尼古丁-D 取样和样品制备 1. 从当地污水处理厂的聚丙烯塑料管中取15mL 24小时平均组成的污水，然后将水样储存在-80℃温度下 2. 将冷冻样品升至室温， 取7mL 等份样品， 在 IEC 临床用离心机上离心 30 min (Thermo IEC， Nutley， NJ)， 最大离心速度为 7100转(5125克) 3. 离心后，将上清液转移到一个6mL的自动进样器的玻璃小瓶中，并添加代内准。所有的样品都要在制备后24小时内完成分析 液相色谱-串联质谱仪器 通过安装900 pL进样升级套件，可以进行1800pL 的大体积进样(安捷伦部件件G1363A)， 升级套件包括 900pL分析进样头、900pL 不锈钢定量环(安捷伦部件号 G1313-87303)和安装在针座接头与分析头的第5个进口的1400pL扩展进样针座(安捷伦部件号 G1313-87308)(图2)。自动进样器的样品瓶(6mL)(部件号9301-1377)，瓶盖(部件号9301-1379)，密封垫(部件号9301-1378)和相应的进样盘(安捷伦部件号 G1313-44503) (图3)。 图2.配置了大体积进样升级套件的 G1313A 型自动进样器的1100液相色谱系统(面板已经拿掉) 液相色谱/三重四极杆质谱联用进行样品分析，待测组分多反应 梯度：监测(MRM)的参数如表1所示。 时间(min) %B 0-9 5 9-13 5 to 20 母离子 子离子 碰撞电压 碰撞解离 待测物 (m/z) (m/z) (V) 能量a(E) 1.甲基苯丙胺 150.0 119.2(91.1) 20(25) 10(15) 2.亚甲二氧基甲 基苯丙胺(MDMA) 194.1 163.4(105.1) 25(30) 10 (25) 3.苯环已哌啶 244.2 159.4 (86.2) 20(20) 10(10) 4.可卡因 304.1 182.3(105.1) 30(35) 20(25) 5.苯甲芽子碱 290.2 168.4(105.1) 20(30) 20 (20) 6.氢可酮 300.2 199.4(171.3) 35(40) 30(40) 7.美沙酮 310.3 265.5(105.1) 25(25) 20(25) 8.羟考酮 316.2 298.5(241.1) 25(25) 20(30) 9.尼古丁 177.1 98.1 (80.0) 30(30) 20(20) 内标 甲基苯丙胺-D 155.1 91.7 20 20 亚甲二氧基甲 基苯丙胺-D 199.2 165.2 25 10 苯环已哌啶-D， 249.4 164.4 15 15 可卡因-D。 307.3 185.5 30 20 苯甲酰芽子碱-D 293.2 171.4 30 20 氢可酮-D。 306.3 202.4 45 30 美沙少-D。 319.4 268.5 25 20 羟考酮-D 319.3 301.5 25 20 尼古丁-D。 180.2 80.1 25 25 13-23 20 23-27 20 to 100 27-29 100 29-30 100 to5 30-35 5 进样体积： 1800pL 洗针： 5%甲酸的异丙醇 质谱条件 模式：ESI正模式 雾化器压力： 气(350psi) 碰撞气： 氩气 离子源温度： 150°C 去溶剂化气体温度： 450°C a碰撞解离能量 毛细管电压： 3.57 kV 液相色谱条件 提取器电压： 3V RF透镜电压： 0.2V 色谱柱： 安捷伦 ZORBAX Eclipse Plus C18 快速高 锥孔气流速： 25 L/h 分离柱，4.6×150 mm， 3.5 um(部件号959963-902)保护： 安捷伦 ZORBAX保护柱(12.5×4.6 mm i.d.)(部件号820950-936)柱温： 35 ℃流动相： A=0.1%乙酸的5%甲醇B=100%乙青流速： 0.5 mL/min 去溶剂化气流速： 650L/h 离子能量1和2： 0.5V和2.0V 入口和出口电位： 11V和25V 结果与讨论 在自动进样程序运行的过程中，进样阀初始时处于“mainpass”的位置，此时样品流向分析柱(图4)。之后，样品被载入分析柱，然后系统阀转至“bypass”，此时，流动相/梯度绕过大体积进样环。因此，梯度到达分析柱头的时间将会会短，减少了分析时间(图4)。色谱分离是在安捷伦的 ZORBAXEclipse Plus C18 快速高分离柱上进行的(图5)。 用新配置的溶于去离子水中的标准溶液建立了八点校正曲线。线性回归系数R2为0.99， 1/X-权重，未强制通过原点。 图4.大体积进样操作的示意图 SID8(样品编号) 尼古丁-696 ng/L 10.00 15.00 TT 20.00 25.00 30.00 尼古丁-D TW10.00 15.00 TTT20.00 25.00 30.00 羟考酮-56ng/L 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 羟考酮-D3 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 氢可酮-74 ng/L 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 氢可酮-D 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 甲基苯丙胺-545 ng/L 20.00 25.00 30.00 甲基苯丙胺-Dg 20.00 25.00 甲基苯丙胺-Dg 20.00 25.00 10.00 15.00 30.00 亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA) -10 ng/L 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA) -D5 个P10.00 15.00 20.00 苯甲酰芽子碱-298 ng/L 25.00 30.00 10.00 15.00 20.00 苯甲酰芽子碱-D 25.00 30.00 10.00 15.00 20.00尼古丁-50 ng/L 25.00 30.00 10.00 15.00 20.00 可卡因-D 25.00 30.00 10.00 15.00 20.00 25.00 苯环已哌啶-9ng/L 30.00 10.00 15.00 20.00 25.00 苯环已哌啶-Ds 30.00 10.00 15.00 20.00 25.00 美沙沙-32 ng/L 学学 30.00 10.00 15.00 20.00 25.00 美沙酮-Dg 30.00 TTTTT10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 时间 图5.本研究所用水样中待测药物的浓度和 MRM 离子流图 1. 从纯溶剂建立的校正曲线得到的非加标废水样品的平均浓度与加标样品测得的浓度值在95%可信区间(CI)几乎相同(表2)。稳定性同位素内标抵消了基质效应的影响，所以可以用溶于去离子化水制成的标准溶液建立的校正曲线直接计算废水中药物的浓度 2. 仪器检测限(IDL) 在 1.5-5.0 ng/L的范围内，定量限(LOQ) 在5-250ng/L范围内(表2) ( 3. 日内和日间的精密度(相对标准偏差，RSD) 在2-11%之间(表2) ) 4. 用去离子化水制成的标准溶液进行测试，没有观察到残留效应 5. 空白和废水样品中内标的原始峰面积相似，证明基质效应降低到最小 表2.LVI-液相色谱-串联质谱系统的仪器检测限(IDL)、定量限(LOQ)线性、准确度、回收率、以及精密度 平均±95%CI (%RSD) 标准溶液建 IDL LOQ 立的校正曲 待测物 (ng/L) (ng/L) 线的计算值 标准添加 日内 日间 甲基苯丙胺 1.5 10 550±11 549±5 7 5 亚甲二氧基甲 基苯丙胺 2.5 5 9.5±0.5 9.6±0.2 5 7 苯环已哌啶 2.5 5 9.7±0.5 9.7±0.1 5 9 可卡因 2.5 5 48±3 49±1 3 6 苯甲酰芽子碱 1.5 10 288±9 284±3 2 5 氢可酮 2.5 10 72±3 70±1 9 11 羟考酮 2.5 10 54±3 54±1 6 8 美沙酮 2.5 5 32±2 29±1 5 8 尼古丁 5.0 250 698±27 703±7 6 8 结论 本应用表明，对于废水中非法和合法使用的药物的分析，大体积进样与液相色谱-串联质谱联用是一种省时的技术。尽管进的样是大体积废水，但是没有出现质谱污染和色谱柱寿命降低的问题。准确度和重现性均满足 EPA 的要求。内标抵消了基质效应的影响。 ( 作者对于 Len o re Kelly， Dawn Ful t on， John Pu r year， John W. Henderson， Jr.， 和安捷伦的 Doug Martin 的技术支持表示由衷的 感谢。 ) ( 参考文献 ) ( 1. Banta-Green， C.J.； Field， J .A.； Chiaia， A.C.； Sudakin， D.L.； Power， L.； de Montigny， L.， The spatial epidemiology ofcocaine， methamphetamine and 3，4-methylene-dioxymethamphetamine (MDMA) use： a demonstrationusing a population measure o f community drug loadderived from municipal w astewater. Addiction 2009，Jul 14 (Early View Section) ) ( 2. Schultz， M . M.； Barofsky， D. F.； Field， J. A.， Quantitative determination of fluorinated alkyl substances by large-volume-injection liquid chromatography tandem mass spectrometry-characterization of municipal wastewaters. Environmental Science an d Technology 2006， 40， ( 1). 289-295. ) ( 3. Huset， C. A.； Chiaia， A. C.； Barofsky， D. F.；Jonkers，N.；Kohler， H .-PE.； O rt， C.； Giger， W.； Field， J . A.， Occurrence and m ass flows of fluorochemicals i n the Glatt Valleywatershed， Switzerland. Environmental Science and Technology 2008，42，( 1 7 ) ，6369-6377. ) ( 4. Chiaia， A. 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