水中4种四环素和9种大环内a脂类抗生素检测方案(固相萃取仪)

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自动化样品前处理解决方案-RK-2019-W004 水中4种四环素和9种大环内a 脂类抗生素药物的测定解决方案 1.介绍 近年来，在水环境中发现个人护理用品及药物的残留引起了人们的广泛关注。抗生素类药作为上述药物的一种，随着畜牧业养殖扩大而大肆用药，常以动物代谢产物随着动物的排泄物，屠宰血水或者人们对于废弃药物的不当处理等方式进入地球的水循环体系。另一方面渔业也有大面积使用抗生素的养殖方式，对水体产生非常大的破坏。 四环素类药物(图1)作为广谱抑菌剂，高浓度时具有杀菌作用。大环内酯类(Macrolides)(2)是由链霉菌产生的一类弱碱性抗生素、因分子中含有一个内酯结构的十四员或十六员员环而得名。然而过多地使用大环内脂类药物会对人体消化道产生极强的副作用，使人恶心，干呕，腹胀腹泻等，严重可致人不可逆的耳聋。 对于上述水环境中，如养殖废水，生活污水及渔业用水等，抗生素含量超标达到纳克每升甚至亚微克每升的污染现状，亟需一种检测手段对水中的抗生素进行检测。固相萃取作为一种富集净化的技术，能够很好将检出限降低至纳克每升，进而让水体中的污染物无所遁形。 关键字：水质；大环内脂类抗生素药物； GC/MS； Fotector plus； Auto EVA-60 图1.四种四环素抗生素结构图 图2.9种大环内脂抗生素结构 2.仪器和耗材 甲醇(优级纯)，水 Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪 3.标准溶液的配制 3.1固相萃取净化条件 Raykol Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪 HLB 固相萃取柱(CNW， 60 mg/3mL) 高效液相色谱(HPLC) Agilent 1260， 质谱检测器(MS) Agilent 6410 全自动固相萃取仪 Fotector Plus高通量全自动固相萃取仪 固相萃取柱 HLB (Waters， Oasis， 60 mg/3 mL) 活化 甲醇 淋洗 水溶液 洗脱 甲醇溶液 3.2样品富集与净化 依次用甲醇(10mL)和水(10mL)以5.0mL/min的速率活化/平衡和淋洗固相萃取柱，备用。取纯净水样200mL， 加入 EDTA-McIlvaine缓冲溶剂(pH=4.0， 50 mL， 0.1 mol/L)调节水环境的 pH 值(采用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节，检测替米考星的水环境 pH值需调节至4.30，检测其余大环内脂和四环素水环境pH为4.90)，以5-7mL/min的速率经固相萃取小柱富集后；水溶溶液10mL以10 mL/min 速率淋洗固相萃取柱中残留的 Na2EDTA；吹干后用 10 mL的甲醇以1.0mL/min 的速率洗脱。具体步骤见图收集的样品在30℃， 5 psi 条件下浓缩至近干，流动相乙腈-水溶液(3：7， v：v)定容至1.0 mL， 供LC/MS-MS分析。 序号 命令 溶剂 排出 流速(mL/min) 体积(L 时间(min) 1 活化 CH30H 废液1 10 10 1.6 2 活化 H20 废液1 10 10 1.6 3 大体积上样 废液1 5 250 62.8 4 淋洗 H20 废液1 5 10 2.6 5 气推 废液1 40 20 1.8 6 吹干 5 7 清洗注射泵 CH30H 10 5 0.9 8 洗脱 CH30H 收集 1 10 10.5 9 气推 20 5 0.8 10 结束 图3. Fotector Plus对水中大环内脂的富集净化方法 4.液质检测条件 4.1色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5um×21 mm×50mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A：10mMI ammonium acetic (0.1% formic acid)，B： Methanol 柱温 35°C 进样体积 10uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350°C 簇电压 4000 雾化压力 35psi 大环内脂：0.0-1.5 min，93%流动相A； 1.5-3.0 min， 60%的流动相A； 3.0-3.5 min 10% 梯度洗脱 流动相A，保持2 min； 5.50-6.0 min， 93%的流动相A； 6.00-10.0 min，93%的流动相A. 四环素：0.0-0.50，80%流动相A；0.50-2.0，30%流动相A，保持2min； 4.00-4.10，90% 流动相A， 保持3 min. 表1.4种四环素和9种大环内脂的串联质谱检测参数 4.3色谱图 下图为4种四环素类样品和9种大环内脂类化 合物的质谱图： 步68898188器ZTI80901070 0 PE08 (000I 9ZF <-0007T9F)0ZICI 0000=300000=40A09II=8ezH WaW ISH+ PE0A8 (000I OIF <-00079)07IDIO 0000=300000=40A00ZI=8B.IH WaW ISH+ 0.20.40.60.811.21.41c8umts象深集时尚3.23.43.63.844.24.4 5.方法可行性验证 5.2样品基质加标测试 5.1基质效应验证 取纯净水样，按照上述的样品处理步骤后，氮吹至近干，加入标准使用液 (1ppm， 20匹)，定容成1mL，供 LC/MS-MS检测。如果基质加标浓度准确，则可以直接用标准曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标做曲线进行单点定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重相等，拟合出工作曲线，要求 R>0.99；此曲线两周需要重新配置一次。 为了验证该方法的回收率，本实验向纯净水(200mL)中加入上述9种大环内脂类和4种四环素类标准(20uL， 1 mg/L)，进行加标回收验证(n=4)。测试结果如表2所示，4种四环素和大环内脂，调节水环境 pH 值为4.90(替米考星单做，调节 pH4.0).9 种大环内脂的回收率在 80.00%-120.00%之间，只有螺旋霉素的回收率在70.60%。4种四环素和9种大环内脂的相对标准偏差均控制在13%以内。说明该方法能够很好地运用于水样中4种四环素和9种大环内脂的检测。 化合物 (Compound) 回收率()样品-1 回收率(%)样品-2 回收率(%)样品-3 回收率(%)样品-4 平均回收率Average RSD(%) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Sample-4 Recoveries(%) 四环素 90.08 95.33 77.90 73.11 84.10 12.30 土霉素 107.41 93.89 78.81 94.35 93.61 12.49 金霉素 112.01 111.00 96.73 89.16 102.23 10.92 强力霉素 107.40 103.62 108.19 108.92 107.03 2.20 林可霉素 120.33 118.83 96.95 97.75 109.72 11.85 克林霉素 85.80 97.58 79.43 80.03 85.71 9.82 替米考星(pH4.3) 94.00 107.04 95.95 79.12 94.03 12.21 红霉素 120.17 97.93 98.26 107.81 106.04 9.88 泰乐霉素 106.58 98.01 95.01 92.99 98.15 6.10 吉他霉素 90.69 93.19 80.12 90.29 88.57 6.53 罗红霉素 91.45 108.84 97.82 92.18 97.57 8.23 交沙霉素 106.02 93.22 102.22 84.97 96.61 9.76 螺旋霉素 75.18 68.01 67.98 71.22 70.60 4.83 表2.纯净水样的加标回收率及 RSD 值(100 ng/L) 6.1对于大环内脂及四环素化合物在水中的富集方法，应考虑实验过程中基质对化合物检测的干扰。此步的干扰不仅来自于水样中杂质干扰，同时商业化的固相萃取小柱，使用的色谱级溶液等等都存在干扰杂质，因此需要进行基质效应确认，以避免前处理富集过程中存在基质效应。 6.2固相萃取柱若为500 mg/6mL 的型号，进行吹干小柱步骤时应延长时间至20 min。最终洗脱液的氮吹浓缩过程中应控制吹干程度，不可过分干燥。 6.3需用10 mL的水溶液进行淋洗，利于将固相萃取小柱中残留的 EDTA 除去，避免其在后续的洗脱液中干扰沙星类化合物的检测。 7.解决方案的优势 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪能同步进行6个样品处理，自自连续处理60个样品，从活化、上样、淋洗到洗脱等多种基础命令全部实现自动化，大大提高了仪器精度和可靠性，保证了回收率。 Auto EVA-60 全自动平行浓缩仪可自动完成对样品的快速，平行浓缩。 邮箱： info@raykol.com热线：址：：Vwww.raykol.com MRM参数热线：址：：Vwww.raykol.com 邮箱： info@raykol.com 近年来，在水环境中发现个人护理用品及药物的残留引起了人们的广泛关注。抗生素类药作为上述药物的一种，随着畜牧业养殖扩大而大肆用药，常以动物代谢产物随着动物的排泄物，屠宰血水或者人们对于废弃药物的不当处理等方式进入地球的水循环体系。另一方面渔业也有大面积使用抗生素的养殖方式，对水体产生非常大的破坏。四环素类药物（图1）作为广谱抑菌剂，高浓度时具有杀菌作用。大环内酯类（Macrolides）（图2）是由链霉菌产生的一类弱碱性抗生素、因分子中含有一个内酯结构的十四员或十六员大环而得名。然而过多地使用大环内脂类药物会对人体消化道产生极强的副作用，使人恶心，干呕，腹胀腹泻等，严重可致人不可逆的耳聋。对于上述水环境中，如养殖废水，生活污水及渔业用水等，抗生素含量超标达到纳克每升甚至亚微克每升的污染现状，亟需一种检测手段对水中的抗生素进行检测。固相萃取作为一种富集净化的技术，能够很好将检出限降低至纳克每升，进而让水体中的污染物无所遁形。