马兜铃，细辛中马兜铃酸及马兜铃内酰胺检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA14-604Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-323 上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996http：//www.shimadzu.com.cn 马兜铃酸及马兜铃内酰胺的含量测定方法建立 LCMSMS-323 摘要：本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用检测中药材及中 药制剂中马兜铃酸及马兜铃内酰胺的方法。该方法在 8 min 内完成4种马兜铃酸及1种马兜铃内酰胺的分离检测，校准曲线相关系数大于0.995，低中高三个浓度连续进样分析5针的保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.03~0.37%和0.7~4.3%之间；仪器检出限在1~5 ng/L 之间，定量限在3~15 ng/L 之间。除此之外，应用本方法对市售含马兜铃酸类中药制剂进行检测，效果理想。该方法分析速度快、重复性好、灵敏度高，适合中药材及中药制剂中马兜铃酸及马兜铃内酒胺的高灵敏度快速检测。 关键词：超高效液相色谱仪三重四极杆质谱仪马兜铃酸马马铃内酰胺 马兜铃酸类化合物主要存在于马兜铃科马兜铃属(AristolochiaL.)植物和细辛属(Asarum L.)植物中，最常见的有马兜铃、关木通、广防己、青木香、天仙藤、细辛等。马兜铃酸类化合物可分为马兜铃酸和马兜铃内酰胺两大类。现代研究表明，马兜铃科植物具有抗肿瘤、抗菌、抗炎、镇痛等药理作用，但长期服用含该类植物的药物可能造成慢性肾衰竭以及肾小管病变。因此，2015年版中国药典删除了关木通、广防己及青木香的药材标准，仅收载天仙藤、马兜铃及细辛的药材标准。近期，权威医学期刊《Science Translation Medicine》发表马兜铃酸与肝癌相关性的文章，文章对亚洲各地肝癌样本进行基因检测发现，大陆47%、台湾78%、东南亚29%的肝癌样品都明确显示与马兜铃酸诱导的细胞突变有关，这一报道引起了媒体和大众的广泛关注。目前，马兜铃酸含量测定方法主要有高效液相色谱 (HPLC)法、毛细管电泳(CE)法、薄层色谱 (TLC)法、液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS) 法等。用 HPLC 法分 析马兜铃酸类药材时，因其紫外吸收波长较低，在含量较低且有杂质干扰时仅依靠 HPLC 的保留时间和特征光谱图定性并不准确。毛细管电泳法灵敏度较低且选择性较差，方法要求大量的样品、试剂及伴随着烦琐的样品制备过程。薄层色谱法的精密度、准确度和灵敏度均较差，实验结果受操作者技能的影响很大。LC-MS/MS 定性准确，分析速度快，已广泛应用于中药化学成分分析、中药质量控制、中药代谢研究以及中药药代代力学研究。但现有文献中，使用LC-MS/MS 进行马兜铃酸检测的方法多仅针对马兜铃酸A 及马兜铃酸B，而针对多种马兜铃酸及马兜铃内酰胺同时进行定性定量的研究未见报道。本文使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060 联用，建立了马兜铃中药材、细辛中药材及含马兜铃酸中药制剂中马兜铃酸及马兜铃内酰胺的定性定量分析方法，该方法操作简捷、分析速度快、重复性好、灵敏度高，供相关检测人员参考。 1.1仪器 本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A 与三重四极杆质谱仪LCMS-8060 联用系统。具体配置为： LC-30ADx2输液泵， DGU-20A5R在线脱气机， SIL-30ACMP 自动进样器， CTO-20AC柱温箱， CBM-20A 系统控制器，LCMS-8060 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver.5.82 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件 色谱柱： Shim-pack GIST (2.1 mmI.D.x50 mmL.， 2.0 um) 进样体积：15pL 流动相：A相-(1mmol/L甲酸铵，0.05%甲酸)水，B相-甲醇 流速：0.4mL/min 柱温：40℃ 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为55%，时间程序见表1。 表1：梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 2.00 Pumps Pump B Conc. 55 6.00 Pumps Pump B Conc. 80 6.10 Pumps Pump B Conc. 55 8.00 Controller Stop 质谱条件 分析仪器：LCMS-8060 化合物结构：见图1 离子源： ESI， 正离子扫描 脱溶剂管温度：200℃ 离子源接口电压：+4.0kV 加热模块温度：400℃ 雾化气：氮气3.0 L/min 接口温度：250℃ 干燥气：氮气10 L/min 扫描模式：多反应监测(MRM) 加热气：空气10 L/min 碰撞气：氩气 碰撞气：氩气 MRM参数：见表2 图1化合物结构式 表2化合物MRM参数 名称 Mol.Wt..(CAS No. 前体离子- 产物离子 Q1 Pre Bias CE Q3 Pre Bias (V) (V) (V) 马兜铃酸A 341.27 313-67-7 359.05 298.00* -13.0 -13.0 -15.0 296.00 -13.0 -16.0 -11.0 马兜铃酸B 311.25 475-80-9 329.05 268.15° -12.0 -12.0 -10.0 294.10 -13.0 -15.0 -15.0 马兜铃酸C 327.25 4849-90-5 345.00 284.05 -24.0 -13.0 -14.0 282.05 -26.0 -20.0 -32.0 马兜铃酸D 357.27 17413-38-6 375.00 312.10° -14.0 -15.0 -24.0 297.05 -14.0 -34.0 -22.0 马兜铃内酰胺 293.27 13395-02-3 294.05 279.10° -12.0 -27.0 -29.0 251.05 -12.0 -35.0 -18.0 注：.**项为定量离子 1.3样品制备 马兜铃：取马兜铃中药材，万能粉碎机粉碎，过三号筛，精密称取0.2g， 加70%甲醇20mL， 超声提取40min， 冷却至室温，用70%甲醇定容至25 mL，精密吸取该溶液1mL，用50%甲醇稀释并定容至25mL， 再精密吸取该溶液1mL，用50%甲醇稀释并定容至100mL， 过 0.22 um滤膜后，上机测定。 细辛：取细辛中药材，万能粉碎机粉碎，过三号筛，精密称取0.2g， 加70%甲醇20 mL， 超声提取40 min， 冷却至室温，用70%甲醇定容至25mL，精密吸取该溶液1mL，用50%甲醇稀释并定容至100 mL， 再精密吸取该溶液1mL，用50%甲醇稀释并定容至10mL， 过 0.22 um 滤膜后，上机测定。 含马兜铃酸液体中药制剂：取本品混匀，精密称取0.2g，加70%加醇20mL， 超声提取40 min， 冷却至室温，用70%甲醇定容至25 mL， 精密吸取该溶液1mL，用50%甲醇稀释并定容至10 mL， 再精密吸取该溶液1mL，用50%甲醇稀释并定容至100 mL， 过 0.22 um 滤膜后，上机测定。 1.4标准曲线制备 用甲醇配制1000 ug/L 马兜铃酸A、马兜铃酸B、马兜铃酸C、马兜铃酸D及马兜铃内酰胺储备液，用50%甲醇水溶液稀释成所需浓度，分别得到2 ng/L、5 ng/L、10 ng/L、20 ng/L、50 ng/L、200 ng/L、500 ng/L、2000 ng/L、5000 ng/L、20000 ng/L 和 50000 ng/L 的标准溶液，上机测定。 结果与讨论 2.1化合物标准溶液的 MRM 色谱图 图2化合物标准溶液的MRM色谱图(500 ng/L) 2.2线性范围 将1.4中制备的标准曲线溶液按1.2中的分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，外标法制作校准曲线，线性方程、线性范围和相关系数见表3。 表3校准曲线参数 序号 名称 校准曲线 线性范围(ng/L) 相关系数r 准确度(%) 1 马兜铃酸A Y=(649.181)X+(690.687) 2~50000 0.9959 87.7~113.9 2 马兜铃酸B Y=(263.457)X+(121.998) 5~50000 0.9964 90.8~113.4 3 马兜铃酸C Y=(120.182)X+(251.781) 5~50000 0.9995 93.0~103.1 4 马兜铃酸D Y=(264.015)X+(140.343) 5~50000 0.9994 92.5~104.0 5 马兜铃内酰胺 Y=(2066.84)X+(1005.76) 1~5000 0.9983 93.0~111.3 2.3检出限和定量限 用50%甲醇配制低浓度混合对照品溶液，将低浓度混合合准溶液按照1.2中的分析条件进行测定，得到5种化合物检出限及定量限，检出限及定量结果见表4，5种化合物的检出限谱图见图3。 表4化合物检出限和定量限 7.5- 5.0- 2.5- 0.0- 序号 化合物名称 检出限(ng/L) 定量限(ng/L) 1 马兜铃酸A 2 5 2 马兜铃酸B 5 15 3 马兜铃酸C 5 15 4 马兜铃酸D 5 15 5 马兜铃内酰胺 1 3 2.4精密度实验 选择低中高三个浓度的混合标准溶液连续5针进样，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的精密度结果如表5所示。5种化合物保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在 0.03~0.37%和0.7~4.3%之间，仪器精密度良好。 表5保留时间和峰面积精密度测定结果(RSD) 化合物名称 浓度1 R.T. Area 浓度2 R.T. Area 浓度3 R.T. Area (ng/L) (ng/L) (ng/L) 马兜铃酸A 50 0.07 2.7 500 0.03 1.2 5000 0.06 1.0 马兜铃酸B 50 0.11 4.3 500 0.06 1.3 5000 0.07 0.7 马兜铃酸C 50 0.22 2.8 500 0.14 2.3 5000 0.08 1.7 马兜铃酸D 50 0.37 3.8 500 0.09 3.7 5000 0.12 0.9 马兜铃内酰胺 50 0.07 2.1 500 0.04 1.8 5000 0.06 1.4 2.5回收率考察 精密称取马兜铃中药材、细辛中药材及含马兜铃酸液体制剂适量，加入低中高三种浓度对照品溶液(每个浓度重复三次)，按照1.3中方法制备，通过计算测得量与加入量的比值，计算回收率，回收率数据见下表6，马兜铃中药材、细辛中药材及含马兜铃酸液体制剂三个浓度回收率分别在88.0%~123.0%、94.4%~113.6%及98.2%~128.8%之间，相关系数分别在0.2%~8.6%、0.8%~7.1%及1.1%~7.7%之间。 表6加标回收率实验结果 化合物名称 加标浓度ng/L 马兜铃回收率/RSD 细辛回收率/RSD 含马兜铃酸液体制剂/RSD 100 未测定* 95.3%/6.0% 102.0%/7.7% 马兜铃酸A 1000 102.6%/0.2% 94.4%/1.1% 105.2%/3.6% 10000 110.7%/1.2% 112.6%/1.0% 115.7%/2.1% 100 91.2%/8.6% 102.4%/7.1% 123.6%/3.3% 马兜铃酸B 1000 97.4%/1.9% 98.5%/4.8% 116.2%/2.2% 10000 104.7%/1.2% 109.6%/1.3% 121.3%/2.3% 马兜铃酸C 100 123.0%/4.7% 102.5%/4.1% 120.8%/7.0% 1000 103.6%/3.7% 103.0%/1.0% 115.5%/2.5% 10000 104.5%/0.8% 108.6%/1.1% 117.2%/1.1% 100 未测定* 未测定* 未测定* 马兜铃酸D 1000 111.7%/4.3% 111.3%/3.6% 128.8%/2.1% 10000 109.3%1.3% 113.6%/0.8% 128.8%/1.6% 马兜铃 10 未测定* 未测定* 未测定* 100 88.0%/1.1% 102.5%/5.7% 98.2%/5.8% 内酰胺 1000 99.2%/1.4% 105.7%/1.4% 101.6%//2.1% 注：*项由于样本中含量较高，故未进行低浓度回收率测定 2.6实际中药材测定结果 对马兜铃中药材及细辛中药材按文中方法测定，测定结果见表7。 表7中药材中马兜铃酸含量和方法检出限(ug/g) 名称 马兜铃酸A 马兜铃酸B 马兜铃酸C 马兜铃酸D 马兜铃内酰胺 含量 检出限 含量 检出限 含量 检出限 含量 检出限 含量 检出限 马兜铃 274.8 0.6 13.2 1.6 182.4 1.6 548.2 1.6 66.7 0.3 细辛 8.3 0.3 N.D. 0.6 N.D. 0.6 102.2 0.6 36.5 0.1 结论 本文使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8060联用，建立了中药材及中药制剂中马兜铃酸及马兜铃内酰胺的含量测定方法。该方法在8 min 内完成4种马兜铃酸及1种马兜铃内酰胺的分离测定，校准曲线相关系数大于0.995， 低中高三个浓度连续5针进样分析的保留时间和峰面积相对标准偏差分别在 0.03~0.37%和0.7~4.3%之间；5种化合物仪器检出限在 1~5 ng/L 之间，定量限在3~15 ng/L 之间。除此之外，应用本方法对市售含马兜铃酸类中药制剂进行检测，效果理想。该方法分析速度快、重复性好、灵敏度高，适合中药材及中药制剂中马兜铃酸及马兜铃内酰胺的高灵敏度快速检测。 岛津全球应用技术开发支持中心 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8060联用检测中药材及中药制剂中马兜铃酸及马兜铃内酰胺的方法。该方法在8 min内完成4种马兜铃酸及1种马兜铃内酰胺的分离检测，校准曲线相关系数大于0.995，低中高三个浓度连续进样分析5针的保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.03~0.37%和0.7~4.3%之间；仪器检出限在1~5 ng/L之间，定量限在3~15 ng/L之间。除此之外，应用本方法对市售含马兜铃酸类中药制剂进行检测，效果理想。该方法分析速度快、重复性好、灵敏度高，适合中药材及中药制剂中马兜铃酸及马兜铃内酰胺的高灵敏度快速检测。