清洁验证：微生物总有机碳回收率和线性

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在生产消费品时，有效地清洁生产设备对质量控制来说至关重要。清洁工艺的目标是降低产品污染的风险，有效的清洁工艺可以将风险降低到可接受的水平，以确保产品质量。如果无法衡量和验证清洁工艺的有效性，就无法了解产品质量和消费者安全的风险。根据美国食品和药品管理局（FDA）提供的数据，2017年食品和饮料行业产品召回的主要原因是微生物对产品的污染。对于减少和消除微生物污染来说，强有力的清洁工艺至关重要，因此监控清洁工艺有效性的方法同样至关重要。清洁验证：微生物总有机碳回收率 和线性 简介 在生产消费品时，有效地清洁生产设备对质量控制来 说至关重要。清洁工艺的目标是降低产品污染的风险，有效的清洁工艺可以将风险降低到可接受的水平，以 确保产品质量。如果无法衡量和验证清洁工艺的有效 性，就无法了解产品质量和消费者安全的风险。 根据美国食品和药品管理局（FDA）提供的数据，2017年食品和饮料行业产品召回的主要原因是微生物 对产品的污染。对于减少和消除微生物污染来说，强 有力的清洁工艺至关重要，因此监控清洁工艺有效性 的方法同样至关重要。 总有机碳（TOC）分析是消费品生产商广泛采用的非 专属方法，用于检测产品、清洁剂、以及微生物等污 染物的残留量。 为了证明 TOC分析法适用于预期用途，我们对设备清 洁之后可能尚存的残留物进行了回收和线性研究。工 厂通常会测试化学污染物和化合物，但很少用 TOC分 析法来测试微生物的回收率。本文旨在探讨对于清洁 验证和确认，TOC分析法能否证明可接受的微生物污 染回收率和线性。 实验设计和设置 我们同科罗拉多大学博尔德分校合作，用一整夜时间 在胰酶大豆肉汤中培养 100毫升枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）。以 4500转/分钟的速度将最终 培养物的十毫升等分试样离心分离 10分钟，形成细胞 沉淀。 在每次离心之间，倒出上面的液体，用涡旋混合方法 用 10毫升超纯水使沉淀细胞重新悬浮。重复此过程 7次。设计淋洗循环以除去细胞培养基带来的 TOC污染。在第 7次淋洗循环后，根据已有的 4,6-二氨基-2-苯基 吲哚（4,6-diaminidino-2-phenylindole，DAPI）染色 任务来对细胞进行重新悬浮、稀释、计数（见图 1）。确定细胞密度之后，用 Sievers* M9 TOC分析仪测量 1 ppm确认标样组，然后进行三次细胞浓度稀释。在 测量 TOC之后，用 0.45 μm灭菌过滤器过滤剩余样品，彻底除去细菌（见图 2）。然后再次测量 TOC以确定 每个样品的非细胞背景 TOC（见图 2）。 图 1：枯草芽孢杆菌在细胞计数的荧光显微镜成像 图 2：枯草芽孢杆菌的过滤过程 结果 细胞密度 原（始p pTbO）C标准偏差 过滤的 标准偏差 校正的 标准偏差 % （细胞/ml） TOC（ppb） （ppb） TOC（ppb） （ppb） RSD 5.80E+05 262 4.04 191 1.71 71 5.75 8.10 5.80E+06 1650 38.3 349 7.85 1301 46.15 3.55 5.80E+07 12400 1450 3270 35.1 9130 1485.1 16.27 过滤的 MilliQ H2O 27 1.83 表 1：微生物细胞密度与 TOC的相关性结果 表 1和图 3是微生物 TOC相关性研究的结果。线性 趋势线的 R2值为 0.9981，表明实测细胞密度有良好 的线性趋势。根据图 3所示的线性拟合趋势线方程，定义为 3倍噪声的检测水平（LOD，Levelof Detection）为 2.74E+ 06细胞/mL。此外，根据线 性拟合趋势线和 M9仪器规格，50 ppm的最大仪器 定量限为 2.49E+ 08细胞/mL。 在进行微生物 TOC定量之后，分别将 1毫升的每种 细胞密度溶液放在不锈钢试样板上进行试样污染，然 后使试样干燥。此试样污染的目的是确定微生物 TOC相关结果的目视检测限。图 4是微生物试样污 染图。 图 3：微生物细胞密度与 TOC的线性关系 图 4：微生物试样板污染 (B) 5.8E+06细胞/mL 讨论与结论 微生物 TOC相关结果和试样污染图都说明了连续监测 已有的清洁工艺有效性的重要性。在理想光线下，很 容易在试样板上看到最高细胞密度（5.8E+ 07细胞 /mL）的污染斑。而对于较低细胞密度，即使光线很好，也很难在试样板上看到污染斑。这表明除了强有力的 清洁工艺之外，还需要用非目测的方法来测试清洁工 艺的有效性。 根据收集的数据，可以想象用于生产消费品的设备上 仍有显著的微生物污染，却仅凭目视检查就被投放到 生产中，导致严重后果。因此必须连续监测已有的清 洁工艺的有效性，才能降低产品质量风险和消费者安 全风险。 最后，由于微生物分子组成的不确定性，很难确定微 生物溶液的回收率。本研究根据先前在确定活性微生 物细胞中的碳含量时的发现，旨在确定微生物溶液的 理论回收率。图 5是理论微生物 TOC产出量的计算过 程。基于每个细胞的碳原子参考数，5.8E+ 07细胞 /mL的理论 TOC浓度为 11.6 ppm。 9.13 ppm measured x100=78.7%Recovery11.6 ppm expected 图 5：理论微生物 TOC产出量的维度分析 在本文的实验中，测量到 5.8E+ 07细胞/mL的 TOC 实际回收值为 9.13 ppm，对挑战性的化合物的回收率 为 78.7%，从而证明实验方法是成功的。 总之，本研究用 Sievers M9 TOC分析仪演示了在清 洁验证和确认时的细胞密度同目视检测限的关系，成 功地证实了微生物 TOC回收率。实验数据支持使用 Sievers TOC分析仪来确认设备清洁度，同时表明除 了目视检查之外还须考虑使用监测微生物污染的定量 方法。TOC分析法是测量残留物、监测清洁工艺、降 低总体风险的有效方法。Sievers分析仪为您提供能解 决您一切清洁验证和确认需求的 TOC解决方案、服务、支持。 参考文献 1. Recall Index and Spotlight. Expert Solutions https://www.stericycleexpertsolutions.com/recall-index/ 2. DAPI Protocol For Fluorescence Imaging Thermo-Fisher Scientific– US https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/ce ll-and-tissue-analysis/protocols/dapi-imaging-protocol.html 3. Phillips,Rob,andRonMilo.“AFeelingfortheNumbersin Biology.” Proceedings of the National Academy of Sciences 106, no. 51 (December 22, 2009): 21465. https://doi.org/10.1073/pnas.0907732106. Veolia Water Technologies 请访问以下网址与我们联系：cn.sieversinstruments.com