胆钙化醇及其两个异构体混合物中胆钙化醇检测方案(液相色谱仪)

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使用 Agilent 1260 Infinity 混合型SFC/UHPLC 系统实现 USP胆钙化醇正相 HPLC 方法向 SFC的转移 应用简报 制药QA/QC 作者 VinayakAKSyed Salman Lateef 安捷伦科技有限公司 印度班加罗尔 摘要 Agilent 1260 Infinity 混合型 SFC/UHPLC 系统结合了 HPLC 的优势以及超临界流体色谱 (SFC)的优点，可提供快速、可靠、环保、稳定且经济有效的解决方案。本应用简报将介绍美国药典(USP)胆钙化醇的正相 HPLC 分析方法向使用串联色谱柱的 SFC 方法的转移。HPLC 和 SFC 方法均在 1260 Infinity 混合型 SFC/UHPLC 系统上完成。结果表明，与 USP 方法相比， SFC 方法不仅符合系统适用性标准且分析速度提高2倍，溶剂成本更是减少了26倍。稳定性性验结果显示， SFC 方法具有良好的稳定性，适用于常规分析。 胆钙化醇是维生素D的一种，也称为维生素 D3。胆钙化醇的USP 分析方法为正相HPLC法，其包括分离胆钙化醇及其两个异构体：胆钙化醇前体和反式胆钙化醇(图1)。 USP分析方法采用甲苯作为样品稀释溶剂，以无水己烷作为流动相。然而，暴露在浓度范围10000到 30000 ppm 的甲苯中将引起昏迷和死亡(WH0，1985)。己烷已列入美国毒性物质排放清单(TRI)中。相比之下，由于 SFC 使用的是无毒溶剂，并将二氧化碳 (CO2)作为流动相的主要成分，因此是一种公认的绿色技术。与正相HPLC 方法相比， SFC 法提供了更快速的分离，而且不影响柱效，柱平衡更快。在SFC 中，由于流动相粘度较低，压降比HPLC 低得多。从而能够将色谱柱串联，实现所需要的分离度。在 SFC 中使用串联柱获得更高柱效和分离度的可能性已得到确认。 本应用简报将介绍使用两根具有不同选择性的串联色谱柱开发一种可替代 USP 正相HPLC 方法进行胆钙化化分析的 SFC 方法。1260 Infinity 混合型 SFC/UHPLC 系统是整合的一台仪器， HPLC 和 SFC 方法均在该仪器上完成。采用这种独特的混合型解决方案可避免投资两个独立的系统，从而排除了系统之间变异性的影响，大大节省了成本和实验室空间。? 图1 胆钙化醇(A)、胆钙化醇前体(B)和反式胆钙化醇的分子结构 实验部分 软件 Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版，修订版 B.04.03。 本实验使用 Agilent 1260 Infinity 混合型SFC/UHPLC 系统，其包含下列模块。 描述 型号 Agilent 1260 Infinity 分析型超临界流体色谱系统 G4309A Agilent 1260 Infinity二元泵 G1312B Agilent 1290 Infinity 通用阀驱动 G1170A Agilent 2位/10通阀工具包-600 bar G4232A Agilent 1260 SFC/UHPLC 混合型毛细管工具包 G4306A 试剂与材料 所有溶剂均为 HPLC级。所用纯净水来自MilliQ水纯化系统(Millipore，美国)。甲醇为超梯度级，级自Lab-Scan 公司。HPLC 级正己烷、甲苯、1-戊醇 (n-戊基乙醇)和胆钙化醇均购自 Sigma-Aldrich公司(印度)。USP维生素D分析系统适用性混合物购自USP(印度)。骨化三醇(胆钙化醇粉末)由 CADILA 制药公司生产，用于制剂实验。 色谱参数 表1显示了在1260 Infinity 混合型 SFC/UHPLC 系统上进行 SFC 分析的色谱参数。当运行正相方法时， SFC 流速和反压调节器(BPR)分别设定为1 mL/min 和90 bar，这样的低值可使系统保持一定的压力。 标样的制备 系统适用性性液(正相HPLC) 取 200 pL USP 维生素D分析系统适用性标样溶解于1200 pL含等量甲苯和正相流动相的混合溶液中。在90°C对溶液回流加热45分钟，再冷却到室温。该溶液含有胆钙化醇、胆钙化醇前体和反式胆钙化醇。 系统适用性溶液的制备(SFC) 100 pL USP 维生素D分析系统适用性标样溶解于200pL 正相流动相(6/1000正戊醇的无水己烷混合溶液)中。使用Eppendorf Thermomixer 舒适型恒温混合器在 90°℃以 300 rpm 的转速使该溶液与400 pL甲醇混合约2个小时并进行加热。该溶液含有胆钙化醇、胆钙化醇前体和反式胆钙化醇。 SFC 耐用性溶液 将1 mg胆钙化醇溶解于10mL甲醇中。 使用 Eppendorf Thermomixer 舒适型恒温混合器在90°℃以 300 rpm 的转速对该溶液进行加热约2个小时。该溶液含有胆钙化醇和胆钙化醇前体。 线性溶液 将胆钙化醇溶解在甲醇中，配制成600 pg/mL的储备液。对储备液进行系列稀释，配制成不同浓度的校准溶液。 ( 标准溶液 ) 称取约 1.6 mg胆钙化醇溶解于2 mL甲苯，然后加入8mL流动相(正相)。 参数 正相 HPLC方法 SFC 方法 色谱柱 Agilent ZORBAXRx-SIL， 4.6×250 mm， Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl， 5pm (部件号880975-901) 4.6×100 mm，5 um(部件号959996-912) Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，4.6×250 mm， 5 pm (部件号959990-902) 检测器 254 nm， 2.5-10 Hz 采集速率 254 and 262 nm， 2.5-10 Hz 采集速率 柱温箱 40℃(柱前和柱后溶剂加热) 40°℃(柱前和柱后溶剂加热) 流通池 高压流通池 10 mm 光程和13pL体积 高压流通池 10mm 光程和13pL体积 进样定量管 5pL(进样3倍定量管体积) 5pL(进样3倍定量管体积) 反压调节器 90 bar 120 bar SFC 流速 1 mL/min 2.5 mL/min 正相流速 1.5 mL/min 0 mL/min 流动相 6/1000正戊醇的无水己烷混合溶液 A：超临界流体 CO， B：甲醇 色谱分析 100%A等度 2%B等度 运行时间 20分钟 10分钟 胆钙化醇制剂溶液 称取1g胆钙化醇粉末(含1.6mg胆钙化醇)溶解于2mL甲苯中，然后加入8mL流动相(正相)。超声处理后，上清液用安捷伦经济型过滤器 Econofilter PTFE，0.20 pm， 25mm (部件号5185-5834) 过滤，然后取滤液进样分析。 步骤 在 Agilent 1260 Infinity 二元泵混合系统中使用正相泵密封垫(部件号09051420)。在正相溶剂进入之前，用异丙醇对泵进行平衡处理。1260 Infinity SFC/UHPLC 混合型系统通过切换2位/10通阀，在正相模式下操作。使用正相系统适用性溶液进行正相分析，测定 USP系统适用性参数。然后再将2位/10通阀切换到 SFC模式进行 SFC 分析，测定系统适用性参数、耐用性和线性。使用 SFC 耐用性测试溶液进行耐用性试验，对6个方法参数进行评价。 测定每个耐用性参数时，采用6次重复进样，计算峰面积和保留时间(RT)。测定与标准 SFC 方法相比的峰面积和保留时间的百分比偏差(准确度%)。 进样分析线性溶液以验证方法的线性。所制备的线性浓度稀释样品如表2所示。胆钙化醇的最大吸收波长是262 nm， 因此，用该波长进行线性研究。进样100%甲醇 作为空白，然后重复进样9个线性浓度的溶液。将在线性范围之内的各浓度下的平均峰面积针对浓度作图得出校准曲线。胆钙化醇的检测限 (LOD) 和定量限(LOQ)即可基于信噪比的最低线性进样得出。 线性浓度 胆钙化醇(pg/mL) 1 8.29 2 18.02 3 38.51 4 77.02 5 148.12 6 224.42 7 307.42 8 385.24 9 458.62 表2胆钙化醇稀释表 结果与讨论 分离与检测 用 SFC 系统适用性溶液对分离条件进行了优化。将 ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl， 4.6x100 mm， 5 um 柱与 ZORBAXEclipse Plus C18， 4.6×250 mm，5 um柱串联进行有效的选择性分离。理想的流速和柱温分别为 2.5 mL/min 和40°C。图2显示了 SFC 方法和USP 正相方法的叠加色谱图。按照USP 方法，将两种方法的检测器均设置在254nm。 用两种方法进行了系统适用性测试。 SFC方法为反式胆钙化醇和胆钙化醇前体提供了更好的分离度(Rs=2.3)。 图2 用正相 HPLC 和 SFC 方法在 254 nm 波长下分离系统适用性混合物。用 SFC 得到了较窄的峰宽 在 SFC 方法中，胆钙化醇和反式胆钙化醇的分离度为2.0。另外，四次重复进样的峰面积精密度也在USP标准限定之内(表3)。 与USP正相方法相比， SFC 的另一优势是显著降低了成本(表4)。根据每次色谱运行的时间计算出节省的分析时间，并根据材料成本计算方法计算出溶剂的节省量。采用 SFC 方法， 每100次分析可节约两倍的分析时间，成本降低26倍。假设分析时间成本为每小时80美元，间接成本将降低至每小时40美元。 耐用性 使用 SFC 耐用性溶液检测方法的耐用性。 6个标准方法参数各不相同(表5)。峰面积和保留时间的允许偏差分别设定为±5%和±3%。带下划线的数字表示结果超过了允许偏差的范围。 USP 正相 HPLC 参数 USP方法 方法 SFC 方法 反式胆钙化醇和胆钙化醇前体的分离度 不小于1 1.9 2.3 胆钙化醇的峰面积(n=4) 峰面积RSD 0.2 0.8 表3 比较 USP 正相 HPLC 方法与 SFC 方法的USP 胆钙化醇系统适用性限度 USP 正相 HPLC 方法 SFC 方法 节约量 每个样品的分析时间(min) 20 10 2x 每100个样品的溶剂成本(美元) 226 8.7 26x 表4 每100次 SFC分析节省的分析时间和溶剂成本 反压和柱温的变化对方法没有影响。进样体积为15pL， 需充满 5pL固定进样定量管三次。15 pL进样体积发生3%的变化不会对方法产生影响。根据 USP的建议，耐用性试验的吸收波长选为254nm。2%的流速变化对胆钙化醇前体的峰面积影响明显，对胆钙化醇和胆钙化醇前体的保留 时间稍有影响。胆钙化醇和胆钙化醇前体的分离度不会因任何耐用性测试参数而发生改变。耐用性试验结果表明，方法在正常使用时是可靠的。即使故意改变方法参数，也能在很大程度上保持性能不受影响。但是，流速和波长等某些参数非常重要，必须小心控制。 胆钙化醇 胆钙化醇前体 参数 变化 %峰面积 %保留时间 分离度 %峰面积 %保留时间 流速： 2.5mL/min±2% 高：2.55mL/min 0.8 0.8 4.5 -0.2 0.7 低： 2.45 mL/min -4.5 -3.7 4.5 -8.0 -3.8 色谱柱：40℃±2.5% 高：41C 0 -0.6 4.5 0.6 -0.6 低：39℃ -0.3 0.8 4.5 3.0 0.7 进样器： 15pL±3% 高：15.5pL -1.0 -0.1 4.5 1.0 低： 14.5pL -0.4 4.5 -0.2 波长：254±1nm 255nm 4.5 0.8 -0.4 253 nm -0.8 4.5 5.7 -0.8 改性剂浓度：2%B±5% 高：2.1%B -1.4 1.2 4.4 1.4 0.8 低： 1.9%B -2.0 -2.5 4.6 -1.5 -2.1 反压：120±2 bar 高：122 0.1 1.9 4.5 4.3 1.8 低：118 -0.3 -2.1 4.5 1.0 -2.0 使用 SFC 方法的LOD、LOQ和线性 信噪比(S/N)>3时的分析物浓度定义为LOD， S/N>10时的分析物浓度定义为LOQ。表6列出 SFC 方法中胆钙化醇的LOD 为 3.8 pg/mL， LOQ 为 8.29 pg/mL。 采用 SFC 方法从胆钙化醇的 LOQ 浓度开始测定其线性浓度溶液。线性校准曲线显示的相关系数(R)值为0.999(图3)， 表明 SFC 作为正相方法的替代方法具有良好的性能。 制剂分析结果 通过分析胆钙化醇制剂溶液，并与标准溶液中检测到的含量进行比较，测定出制剂中胆钙化醇的含量。同一份样品分别用正相和 SFC方法进行分析。两个方法对制剂中的胆钙化醇含量的分析结果相似(表7)，说明两个方法的准确度相似。 LOD LOO 线性范围 名称 pg/mL 信噪比 pg/mL 信噪比 (pg/mL) R²值 浓度水平数 胆钙化醇 3.80 9.2 8.29 14.04 8.3-458.6 0.999 9 表6 使用 SFC 方法分析胆钙化醇的 LOD、LOQ和线性 图3 胆钙化醇的线性曲线 方法 表1分析结果(1g制剂中的mg) 表2分析结果(1g制剂中的mg) SFC方法 2.0 1.8 正相HPLC方法 2.0 1.9 表7 结论 我们用 Agilent 1260 Infinity 混合型 SFC/UHPLC 系统开发了新的 SFC 胆钙化醇分析方法，并将该方法与原 USP 正相 HPLC方法进行了比较。采用串联色谱柱使胆钙化醇及其两个异构体得到了有效的分离。在符合系统适用性要求的情况下， SFC 方法比正相 HPLC方法速度快2倍，成本节省26倍。另外，用两种方法对两组制剂中胆钙化醇的含量测定，给出了相似的结果。 SFC 方法的线性和耐用性结果令人满意， LOD 值约为4ppm。另外，采用 SFC方法不需要购买和消耗价格昂贵且对环境有害的化学试剂。因此， SFC 方法提供了一种快速、环境友好、经济有效的解决方案。 ( 参考文献 ) 1. ( Melissa N. Dunkle 等人，"High resolution separations by supercriticalfluid chromatography using a coupled column approach with the Agilent 1 260Infinity Analytical SFC System"(使用串联色谱柱方法和 Agilent 1260 Infinity 分 析型 SFC 系统通过超临界流体色谱实现高 分离度分离)，安捷伦应用简报，出版号 5990-6934EN，2010 ) 2. ( Martin Vollmer， Markus Becker， “Agilent 1260 I n finity Hybrid SFC/UHPLC System” (A g ilent 1260 Infinity 混合型 SFC/UHPLC系统)， ) ( 安捷伦技术概览，出版号5990-9514EN， ) www.agilent.com/chem/sfc ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2012 2012年12月1日，中国出版 5991-1456CHCN Agilent Technologies Agilent Technologies 摘要Agilent 1260 Infinity 混合型 SFC/UHPLC 系统结合了 HPLC 的优势以及超临界流体色谱 (SFC) 的优点，可提供快速、可靠、环保、稳定且经济有效的解决方案。本应用简报将介绍美国药典 (USP) 胆钙化醇的正相 HPLC 分析方法向使用串联色谱柱的 SFC 方法的转移。HPLC 和 SFC 方法均在 1260 Infinity 混合型 SFC/UHPLC 系统上完成。结果表明，与 USP 方法相比，SFC 方法不仅符合系统适用性标准且分析速度提高 2 倍，溶剂成本更是减少了 26 倍。稳定性试验结果显示，SFC 方法具有良好的稳定性，适用于常规分析。前言胆钙化醇是维生素 D 的一种，也称为维生素 D3。胆钙化醇的 USP 分析方法为正相 HPLC 法，其包括分离胆钙化醇及其两个异构体：胆钙化醇前体和反式胆钙化醇。USP 分析方法采用甲苯作为样品稀释溶剂，以无水己烷作为流动相。然而，暴露在浓度范围 10000 到 30000 ppm 的甲苯中将引起昏迷和死亡 (WHO, 1985)。己烷已列入美国毒性物质排放清单 (TRI) 中。相比之下，由于 SFC 使用的是无毒溶剂，并将二氧化碳 (CO2) 作为流动相的主要成分，因此是一种公认的绿色技术。与正相 HPLC 方法相比，SFC 法提供了更快速的分离，而且不影响柱效，柱平衡更快。在 SFC 中，由于流动相粘度较低，压降比 HPLC 低得多。从而能够将色谱柱串联，实现所需要的分离度。在 SFC 中使用串联柱获得更高柱效和分离度的可能性已得到确认。本应用简报将介绍使用两根具有不同选择性的串联色谱柱开发一种可替代 USP 正相 HPLC 方法进行胆钙化醇分析的 SFC 方法。 1260 Infinity 混合型 SFC/UHPLC 系统是整合的一台仪器，HPLC 和 SFC 方法均在该仪器上完成。采用这种独特的混合型解决方案可避免投资两个独立的系统，从而排除了系统之间变异性的影响，大大节省了成本和实验室空间。结论我们用 Agilent 1260 Infinity 混合型 SFC/UHPLC 系统开发了新的 SFC 胆钙化醇分析方法，并将该方法与原 USP 正相 HPLC 方法进行了比较。采用串联色谱柱使胆钙化醇及其两个异构体得到了有效的分离。在符合系统适用性要求的情况下，SFC 方法比正相 HPLC 方法速度快 2 倍，成本节省 26 倍。另外，用两种方法对两组制剂中胆钙化醇的含量测定，给出了相似的结果。SFC 方法的线性和耐用性结果令人满意，LOD 值约为 4 ppm。另外，采用 SFC 方法不需要购买和消耗价格昂贵且对环境有害的化学试剂。因此，SFC 方法提供了一种快速、环境友好、经济有效的解决方案。