牛血清白蛋白中分离SDS-蛋白质复合物检测方案(毛细管电泳仪)

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来亨科学仪器Laiheng Lab-Equipment 毛细管无胶筛分电分离 SDS-蛋白质复合物 一、实验原理 毛细管电泳是离子或荷电离子以电场为驱动力，在毛细管中根据据度或/和分配系数的差异进行高效快速分离的一种电泳技术。毛细管电泳和传统电泳的根本区别在于前者设法使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，从而可以引入高的电场强度，全面改善分离质量。 电泳时，毛细管内部首先充满分离缓冲溶液，样品从毛细管的一端导入，当毛细管两端加上一定的电压后，荷电溶质便朝与其极性相反的电极方向移动，由于样品各组分间间度不同，引起迁移速度的差异，因而经过一定时间后，各组分按其淌度大小顺序，依次到达检测器被检出，得到按时间分布的电泳图谱。 北京来亨科学仪器有限公司 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 本实验系采用无胶筛分原理分离 SDS-蛋白质复合物，并用于蛋白质的相对分子质量测定，电泳分离SDS-蛋白质及测定相对分子质量的原理。无胶筛分是在常规 CGE 技术基础上发展起来的，后者与传统的平板凝胶电泳分离的原理无异，都是根据分子的大小分离。我们知道，凝胶筛分介质是指以化学交联方式形成的胶状多孔物质，一旦成型，即很难改变，如聚丙烯酰胺。所谓无胶筛分介质是由缠绕的聚合物以物理方式组成的分离介质，如线形聚丙烯酰胺、纤维素衍生物等，在溶液中形成一定大小的动态孔径，在 CGE中，凝胶胶细管柱制备困难，寿命短，进样易堵塞等缺点，在CE的应用受到很大限制。而采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度的交联聚合物，可克服上述缺点，其物理参数可通过线性聚合物的种类、浓度等予以调节，而且每次分离后毛细管中的筛分缓冲液都要重新更换，因此，重现性很高。 目前，无胶筛分技术已广泛用于分离寡核甘酸、核酸片段、PCR产物， DNA测序以及分离SDS-蛋白质复合物，后者已成为鉴定蛋白质纯度和测定蛋白质相对分子质量的一个重要手段。 二、实验用品 (一)器材 (1)毛细管电泳仪。 (2)微型离心机。 (3)恒温水浴锅 (二)试剂 (1) CE-SDS 蛋白样品缓冲液。 北京来亨科学仪器有限公司 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A (2)0.1mol/L NaOH。 (3)0.1mol/L HCL. (4) CE-SDS 蛋白电泳缓冲液。 (6) CE-SDS 内标 (1mg/mL苯甲酸)。 (7) CE-SDS 蛋白标准：包括8种蛋白 (20mg/mL)。 (三)材料 电泳纯的牛血清白蛋白、卵蛋白溶菌酶和细胞色素C。 三、实验程序 (一)操作方法 1.样品制备 此样品制备过程定量地将样品中的蛋白质转化为 SDS-蛋白质复合物。用 CE-SDS蛋白样品缓冲液按1：1稀释样品，然后加入 CE-SDS 蛋白内标使其最终浓度为 50ug/ml， 将将品置95~100℃水浴10min，然后冷却样品，并在微型离心机上离心 2min。电泳前保持室温。样品与标样的混合液须实验当天配制。如果样品需要还原处理，则应在加热前加入还原剂，如巯基乙醇，终浓度为2.5%，或加二硫代苏糖醇，终浓度为 15mmol/L。 2.蛋白质标准的制备 CE-SDS 蛋白标准含100mmol/L DTT，此时蛋白处于还原状态，而DTT在制备的标准溶液中的最终浓度应为15mmol/L。将 10pL CE-SDS 蛋白标准液、100pL CE-SDS 蛋白样品缓冲液夜 10pL CE-SDS内标混合，再加入80pL双蒸水， 使总体积为 200pL，混合液于加盖的 ( 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A ) 500uL离心管中，置95~100℃水浴 10min， 冷却后，在微型离心机中离心2min，电泳前放于室温。 3、毛细管的类型和准备 因电泳缓冲液中筛分介质具有较高粘度， 内径 50pm的毛细管在 100psi 压力下可获得足够的冲洗体积，毛细管长度为24cm时， 可得到较好的实验结果较短的电泳时间。 3.缓冲液制备 CE-SDS电泳缓冲液在使用之前必须除去气泡，在缓冲液移入离心管后，先在微型离心机上离心 2min，然后插入至仪器的自动样品转盘。。 5.电泳实验条件设置 电泳条件设置如下：极性：从负到正；进样方式：电动进样，10KV 5S；电泳电压：15KV；电流上限50uA；电泳时间：15min；检测波长：220nm；毛细管温度：20℃；样品室温度：20℃。 6.电泳k“关闭程序”的设置 电泳后用 0.1mol/L NaOH 冲洗 60S， 再用水冲洗120S。具体设置如下： 电极：从负到正 缓冲液：双蒸水 进样：无 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心：北京金桥科技产业基地 景盛南二街33号4号楼4层 电泳电压： OKV 电流域值：0.3uA 检测波长：220nm 电泳时间：1.0min 毛细管温度：20℃ 样品及试剂室温度：20℃ 7.运行 由仪器操作人员设置实验程序，然后仪器自动进行电泳。最后利用软件绘图并计算品相对分子质量。 销售中心：北京丰台区丰北路甲45号鼎恒中心6A 技术中心：北京金桥科技产业基地 景盛南二街33号4号楼4层 技术中心：北京金桥科技产业基地景盛南街楼层 技术中心：北京金桥科技产业基地景盛南街楼层 实验原理毛细管电泳是离子或荷电离子以电场为驱动力，在毛细管中根据淌度或/和分配系数的差异进行高效快速分离的一种电泳技术。毛细管电泳和传统电泳的根本区别在于前者设法使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，从而可以引入高的电场强度，全面改善分离质量。 电泳时，毛细管内部首先充满分离缓冲溶液，样品从毛细管的一端导入，当毛细管两端加上一定的电压后，荷电溶质便朝与其极性相反的电极方向移动，由于样品各组分间淌度不同，引起迁移速度的差异，因而经过一定时间后，各组分按其淌度大小顺序，依次到达检测器被检出，得到按时间分布的电泳图谱。本实验系采用无胶筛分原理分离SDS-蛋白质复合物，并用于蛋白质的相对分子质量测定，电泳分离SDS-蛋白质及测定相对分子质量的原理。无胶筛分是在常规CGE技术基础上发展起来的，后者与传统的平板凝胶电泳分离的原理无异，都是根据分子的大小分离。我们知道，凝胶筛分介质是指以化学交联方式形成的胶状多孔物质，一旦成型，即很难改变，如聚丙烯酰胺。所谓无胶筛分介质是由缠绕的聚合物以物理方式组成的分离介质 ，如线形聚丙烯酰胺、纤维素衍生物等，在溶液中形成一定大小的动态孔径，在CGE中，凝胶毛细管柱制备困难，寿命短，进样易堵塞等缺点，在CE的应用受到很大限制。而采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度的交联聚合物，可克服上述缺点，其物理参数可通过线性聚合物的种类、浓度等予以调节，而且每次分离后毛细管中的筛分缓冲液都要重新更换，因此，重现性很高。 目前，无胶筛分技术已广泛用于分离寡核甘酸、核酸片段、PCR产物，DNA测序以及分离SDS-蛋白质复合物，后者已成为鉴定蛋白质纯度和测定蛋白质相对分子质量的一个重要手段。 二、实验用品（一）器材（1）毛细管电泳仪。（2）微型离心机。（3）恒温水浴锅（二）试剂  （1）CE-SDS蛋白样品缓冲液。（2）0.1mol/L NaOH。   （3）0.1mol/L HCL。         (4)CE-SDS蛋白电泳缓冲液。       （5)CE-SDS内标（1mg/mL苯甲酸）。       （6）CE-SDS蛋白标准：包括8种蛋白（20mg/mL）。       （三）材料         电泳纯的牛血清白蛋白、卵蛋白溶菌酶和细胞色素C。