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RNA提取与纯化 一、目的 掌握RNA提取的基本技术,了解RNA提取过程中的各种注意事项。 二、原理 RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。 RNA提取和DNA提取有类似的地方,因为它们都是核酸,都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞,然后用提取液将RNA溶出,反复抽提去除蛋白质,加入乙醇沉淀RNA,将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开?DNA和RNA的溶解性不同,DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度,而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度,所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外,RNA的分子量一般比较小,而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体,所以DNA更容易随蛋白沉淀,而RNA具有较好的溶解性。 RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1%的DEPC水37℃过夜浸泡,然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水,而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应,应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。 判断RNA 的质量主要有两个标准,一是纯度,二是完整性(是否被降解)。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260/A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明,未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带(如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带)。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳,则用尽量减少电泳时间。 三、试剂与器材 (一)试剂 1、暗培养7天的小麦苗,用前光照诱导3 h 2、DEPC 3、DEPC处理的ddH2O 4、RNA提取液:(每1000毫升中含有) Tris 6.06 克 (最终浓度为50 mM ) LiCl 6.03 克 (LiCl -H2O9.06克) (最终浓度为150 mM ) EDTA(0.5 M) 10 毫升 (最终浓度为5 mM ) SDS 50 克 (最终浓度为5 % ) 5、8 M Li Cl:33.92克Li Cl 溶于100 ml DEPC处理的ddH2O 1、 水饱和酚 2、 氯仿 3、 0.5M NaCl 4、 溴乙啶(EB): 10mg/ml溴乙啶。 注意:该试剂具致癌作用,用时要小心。 10、点样缓冲液Loading buffer(10×):0.25%溴酚蓝,40%甘油。 二、器材 1、 分光光度计 2、 电泳仪 3、 台式离心机 4、 手提式紫外监测仪 5、 恒温水浴 6、 凝胶成像系统 四、操作步骤 1、取植物叶片1-3克,放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些,然后分装,小量提取试剂量可减至1/10) 2、液氮挥发完之前,倒入含有10 毫升RNA提取液的离心管中,迅速反复倒置混匀,直至看不见任何团状物为止。 3、立即加入10毫升的等体积(酸性)酚/氯仿,剧烈(!)反复倒置混匀5至10min(如在震荡器上震荡,要确保混匀而不能仅仅是振动!)。 4、13000g×5min,吸管取上清(注意避免吸取界面上的蛋白)。 5、重复步骤3和4,三次左右(注意观察界面上白色物质)。 6、取上清,加入等体积的氯仿,反复倒置混匀2-5min。 7、13000g×5min。 8、取上清,加入1/3体积8 M 的 LiCl (即8 M LiCl应占最后体积的25%), 沉淀RNA,4℃过夜。 9、离心13000g × 10 min。 10、弃上清,保留沉淀(此时应把RNA沉淀转入Eppendorf管中,以便于操作), 加入70%无水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗涤沉淀数分钟(和缓地反复倒置混匀),离心 (13000g × 2 min)。重复洗涤沉淀数次。 11、用70%乙醇再洗涤2次沉淀,去掉盐离子。 12、用枪头吸去残留的液体,真空干燥2min。 13、加入200ulDEPC 处理过的水溶解RNA。 14、取用5ul电泳检测RNA完整性, 用TEB 缓冲液, 200V× 20-30min。 15、取5 ul稀释40倍测定RNA纯度和浓度,A260 nm /A280 nm应在 2.0 左右。 16、将RNA 分装,放在-70℃长期保存备用. 辅助方案:试剂盒提取法(Trizol) (一)试剂: 1.Ttizol Reagent 2.氯仿 3.异丙醇 4.70%无水乙醇 5.DEPC (二)器材: 1、研钵 2、离心机 (三)实验步骤 1、称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末,迅速转移到1.5ml离心管中。 2、加入1 ml Trizol Reagent,15~30℃×5min。 3、加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15 sec,15~30℃×3min。 4、冷冻离心12 000 rpm×15min。 5、将上清液转移到另一个离心管中,加0.5ml预冷异丙醇,混匀 ,-20℃放置20min。 6、冷冻离心12 000 rpm×10min。 7、加入0.5ml 70% 乙醇洗RNA沉淀,悬浮,7500 rpm×2min,除去乙醇。 加入30 ul DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。 一、目的掌握RNA提取的基本技术,了解RNA提取过程中的各种注意事项。二、原理RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。RNA提取和DNA提取有类似的地方,因为它们都是核酸,都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞,然后用提取液将RNA溶出,反复抽提去除蛋白质,加入乙醇沉淀RNA,将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开?DNA和RNA的溶解性不同,DNA在1M的盐溶液中具有最HAO的溶解度,而RNA在0.14M的盐溶液中具有最HAO的溶解度,所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外,RNA的分子量一般比较小,而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体,所以DNA更容易随蛋白沉淀,而RNA具有较好的溶解性。RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1%的DEPC水37℃过夜浸泡,然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水,而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应,应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。判断RNA 的质量主要有两个标准,一是纯度,二是完整性(是否被降解)。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260/A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明,未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带(如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带)。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳,则用尽量减少电泳时间。三、试剂与器材(一)试剂1、暗培养7天的小麦苗,用前光照诱导3 h2、DEPC3、DEPC处理的ddH2O4、RNA提取液:(每1000毫升中含有)Tris 6.06 克 (最终浓度为50 mM )LiCl 6.03 克 (LiCl -H2O9.06克) (最终浓度为150 mM )EDTA(0.5 M) 10 毫升 (最终浓度为5 mM )
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上海远慕生物科技有限公司为您提供《RNA中提取方法检测方案(抗体 试剂盒)》,该方案主要用于其他中提取方法检测,参考标准《暂无》,《RNA中提取方法检测方案(抗体 试剂盒)》用到的仪器有DEPC水7732-18-5 、DEPC-PBS溶液(活跃)、DEPC处理水(0.1%)。
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