肉制品中4种四环素药物检测方案(固相萃取仪)

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Raykol Applications Collection-RKFT-F004 全自动固相萃取-高效液相色谱法串联质谱测定肉制品中4种四环素药物 近年来，在水环境中发现个人护理用品及药物的残留引起了人们的广泛关注。抗生素类药作为上述药物的一种，随着畜牧业养殖扩大而大肆用药，常以动物代谢产物随着动物的排泄物，屠宰血水或者人们对于废弃药物的不当处理等方式进入地球的水循环体系。另一方面渔业也有大面积使用抗生素的养殖方式，对水体产生非常大的破坏。 四环素类药物(图-1)作为广谱抑菌剂，常常作为饲料添加剂，可能导致动物中肌肉，脂肪或者 肝脏部位抗生素药物的残留。如果人食用这种抗生素残留的肉制品，很可能导致人体间接摄入四环素类药物，对身体产生伤害。 本实验参考国标《GB/T 21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱质谱法与高效液相色谱法》，建去基于 FotectorPlus全自动固相萃取仪对猪肉中四环素的检测项目的净化方法。 图-1.四种四环素抗生素结构图 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；四环素抗生素 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪 高效液相色谱(HPLC) Agilent 1260，质谱检测器(MS) Agilent 6410 氮气吹干装置： Raykol AutoEVA-60全自动平行浓缩仪 HLB 固相萃取柱(CNW， 500 mg/6mL 或者 3.样品制备与净化 3.1提取 3.1.1方法-1 称取5g匀浆好的样品于 50 mL离心管中分别用20 mL上述的NaEDTA-McIlvaine 缓冲液，漩涡1 min，冰水浴超声10 min， 提取三次；3000 r/min离心，合并上清液，定容成50 mL， 混匀 5000 r/min离心，用快速滤纸过滤；准确量取 10 mL 上清液转移 Fotector Plus全自动固相萃取仪上样瓶中待净化。 甲醇(优级纯)，水 NazEDTA (0.1 mol/L)-McIlvaine(0.1M)缓冲溶液(pH4.0)， 准确60.2 g乙二胺四乙酸二钠，磷酸氢二钠17.8 g和柠檬酸21.0 g与烧杯中，加入1000 mL 的纯净水，加入浓盐酸调节 pH值至4.0。 3.1.2方法-2 准确称取搅碎后的动物源性样品 5.0g于50mL 离心瓶中，加入2.0 g无水硫酸钠，加入20 mL乙腈进行提取，均质 1.0 min，3800 转离心5.0 min。取上清液于100 mL分液漏斗中，加入30 mL 正己烷(或采用 10 mL正己烷除脂)，振摇20次，静置取下层乙腈溶液；重复上述步骤一次。将所得乙腈溶液于全自动浓缩仪上浓缩至近干(30℃，5 psi)， 加入10 mL 的Na2EDTA(0.1 mol/L)-McIlvaine(0.1M)缓冲溶液(pH4.0)摇匀备用。 3.2 固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus/睿科Auto SPE 固相萃取柱 HLB(Waters， Oasis， 500 mg/6 mL) 活化 甲醇 淋洗 pH 4.0甲酸水溶液 洗脱 甲醇溶液 3.3净化 活化 HLB 柱 (Oasis 500 mg， 6 mL)后，将上述的样品溶液以 2 mL/min 的速度进行上样，并用3 mL的甲酸水溶液(pH4.0)清洗样品瓶。以5 mL 的20%酸化甲醇溶液(pH=4.0)对固相萃取柱进行淋洗。在20 psi 的氮气流下吹干 HLB 柱，最后以10 mL的甲醇洗脱目标化合物(具体的净化步骤请见图-2)。将所得洗脱液在浓缩仪上进行吹干，氮气压力为5psi， 温度为30℃，浓缩至近干，以30%甲醇水溶液定容至1mL，上机测试。 分别以5mL 甲醇和5 mL 甲酸水溶液(pH4.0) 序号 命令 溶剂 排出 流速[mL/min 体积[mL) 时间Cmin〕 1 清洗样品通道 CH30H 40 5 1.7 2 活化 CH30H 废液1 5 5 1.4 3 活化 pH4.0 Formic Acid/Water 废液1 5 5 1.4 4 上样 废液1 3 10 4.1 5 清洗样品瓶 pH4.0 Formic Acid/Water 废液1 60 3 1.8 6 淋洗 Methol (20%ACID) 废液1 5 10 2.6 7 淋洗 pH4.0 Formic Acid/Water 废液1 5 10 2.6 8 气推 废液1 10 10 1.8 9 吹干 10 10 清洗注射泵 CH30H 20 2 0.5 11 洗脱 CH30H 收集 2 10 5.6 12 气推 收集 10 5 1.1 13 结束 图-2. Fotector Plus 四环素固相萃取净化方法 4.检测条件 4.1 色谱柱条件 流速 0.200 mL/min 流动相 A： 10mM ammonium acetic (0.1% formic acid)， B： Methanol 柱温 35°C 进样体积 10 uL 检测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350°C 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 四环素： 0.0-0.50 min， 80%流动相A； 0.50-2.0 min， 30%流动相A， 保持2 min； 4.00-4.10 min， 90%流动相A， 保持3 min。 表-1.4种四环素的串联质谱检测参数 Compound Name Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Cell Accelerator Energy Voltage 445.2 427.1 40 120 6 7 四环素 410.1 40 120 14 7 154 40 120 26 7 土霉素 461.2 443.2 40 115 8 7 426.1 40 115 12 7 金霉素 479.2 444.1 40 120 18 7 462 40 120 12 7 强力霉素 445 428.1 40 125 14 7 321.1 40 125 30 7 267.1 40 125 38 7 4.3 MRM 色谱图 图为四种四环素类化合物标准溶液(50ppb) 在液质上的质谱图： 四环素 +ESI MRM Frag=115.0V CF=0.000 DF=0.000 CID@12.0 (461.2000->426.1000) BY03.d 土霉素 2.12.22.32.42.52.62commsvs.采集时间3.43.53.63.73.83.9 金霉素 +ESI MRM Frag=125. 0V CF=0. 000 DF=0.000 CID@30.0 (445.0000->321.1000) BY03.d 强力霉素 5.样品测试 5.1基质效应验证 取空白样品，按照上述的样品处理步骤，加入标准使用液(1ppm， 40 pL)， 定容成1mL， 供LC/MS-MS检测，工作曲线计算。如果基质加标浓度准确，则可以直接用标示曲线对样品进行定量；如果不准确，请使用基质加标做工作曲线进行单点定量。 选择定量离子的峰面积作为纵坐标，浓度作为横坐标，做相关曲线，曲线为线性回归，各点权重相等，拟合出工作曲线，要求R’>0.99；此曲线两周需要重新配置一次。 5.2样品基质加标测试 为了验证该方法的回收率，本实验向猪肉样品(5g)中加入上述4种四环素类标准品(40pL，1 mg/L)，进行加标回收验证(n=3)。测试结果如表-2所示，4种四环素回收率在 74.00-123.00%之间。4种四环素相对标准偏差均控制在9.00%以内。说 明该方法能够很好地运用于动物源性样中4种四环素的检测。 表-2.动物肉制品中的加标回收率及 RSD 值(40ug/kg) 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 样品-1 样品-2 样品-3 Average RSD(%) (Compound) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Recoveries (%) 四环素 111.94 122.13 123.26 119.11 5.23 土霉素 110.84 94.31 107.82 104.32 8.44 金霉素 78.67 74.70 73.70 75.69 3.48 强力霉素 76.61 87.95 80.38 81.64 7.08 6.结果与讨论 6.1样品提取过程中可以采用两种方式进行提取，但是最终都必须以 Na2EDTA-McIlvaine 缓冲液进行 pH 值调节后，方可进行固相萃取柱净化。否则四环素化合物容易与动物样品中含有的微量金 7.仪器特征优势 本方法可实现四环素药物净化过程自动化，将提取液通过 Fotector Plus 全自动固相萃取仪进行净化，解放实验室人员手动添加溶剂以及人为看守的烦恼，同时也避免实验室人员长时间接触溶剂，影响健康问题；全自动化固相萃取仪的高效性以及良好的平行性，不仅解决样品量多的问题，而且也提 属元素络合，可能导致其在固相萃取柱上无法保留，最终使得加标回收率较低。 6.2对于最终洗脱液氮吹应控制在近干状态，不可氮吹至干，否则可能导致回收率损失。 高实验室的工作效率；净化完后的洗脱液可直接转移至 Auto EVA-60 浓缩仪进行平行浓缩，减少羊品转移次数，同时可设置相应时间，试样品浓缩到相应的体积，避免实验室人员担心样品出现吹干的问题，轻松地解决实验室人员的烦恼，减轻实验室人员工作量。 全自动均质器样品提取 全自动固相萃取仪 全自动浓缩仪 样品净化 样品浓缩 邮箱： info@raykol.com热线：址：：www.raykol.com 网址：： www.raykol.com 邮箱： info@raykol.com热线： 本实验参考国标《GB/T 21317-2007动物源性食品中四环素类兽药残留量检测方法液相色谱-质谱质谱法与高效液相色谱法》，建立基于Fotector Plus全自动固相萃取仪对猪肉中四环素的检测项目的净化方法。