小麦粉和玉米粉中呕吐毒素检测方案(固相萃取仪)

智能文字提取功能测试中

Raykol Applications Collection-RKFT-F008 全自动固相萃取-高效液相质谱联用测定小麦粉和玉米粉中的呕吐毒素 图-1.3种呕吐毒素的结构式(左DON， 中3-ADON，右15-ADON) 及玉米粉基质中对呕吐毒素的前处理和检测分析方法，对于三种呕吐毒素的加标回收率在85-105%之间。 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；呕吐毒素 2.仪器、试剂以及耗材 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪呕吐毒素免疫亲和柱 (Romer， 60 mg/3 mL) 氮气吹干装置： Raykol AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪 Raykol AH-30全自动均质器 3.样品提取与净化 3.1样品提取 3.1.1大豆类或者玉米类固体样品 准确称取5g粉碎后的大豆类谷物或玉米粉于50 mL 离心管中，加入20 mL 水溶液提取，采用AH-30全自动固相萃取仪自动化均质3min 后，离心5 min (转速3800 r/min)。取上清液定性滤纸过滤，准确移取滤液2 mL 至 10mL 玻璃上样管，备用. 3.1.2空白样品 空白样品以已知空白大麦粉为样品，进行上述 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站 高效液相色谱：(HPLC) Agilent 1260， 质谱检测器：：(MS-MS) Agilent 6410 实验操作。 3.2固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科 Fotector Plus/Fotector 02HT 固相萃取柱 呕吐毒素免疫亲和柱 (Romer， 60mg/3mL) 淋洗 PBS 缓冲液和纯水 洗脱 甲醇 3.3固相萃取净化 以1 mL/min 的速度上样2 mL 待测液，5mLPBS缓冲溶液润洗样品瓶，5 mL水淋洗，气推50mL 直接上机测试。详细步骤见图-2。(Fotector Plus 上下位机软件版本在v2.21以上) 吹干免疫亲和柱，推速为 160 mL/min； 最后以2 mL的甲醇，，以0.2-0.3 mL/min 的速度洗脱样品(若样品浓度>2 mg/kg， 放慢洗脱速度至 0.1 mL/min)， 序号 命令 溶剂 排出 流速 [mL/min] 体积(mL) 时间(min) 1 清洗样品通道 CH30H 40 2 1.2 2 特殊上样 废液1 2 2 1.4 3 清洗样品瓶 H20 废液1 80 3 2.3 4 淋洗 H20 废液1 4 7 2.2 5 气推 废液1 160 40 2.6 6 清洗注射泵 CH30H 80 1二 0.3 7 洗脱 CH30H 收集 0.5 1.7 3.7 8 气推 收集 0.3 2 7.1 9 气推 收集 20 15 1.8 10 结束 图-2. Fotector Plus 对呕吐毒素的固相萃取净化方法 4.液质检测条件 4.1色谱柱条件 色谱柱 流速 流动相 柱温 进样体积 检测器 离子模式 吹扫气 氮气温度 簇电压 雾化压力 梯度洗脱 Waters XBridge BEH HILIC 2.5 pmx2.1 mmx50 mm 0.300 mL/min A： HO (0.1% formic acid)， B： Methanol (0.1% formic acid) 40 °C 10 pL Agilent 6410 ESI 11 L/min 350°C 4000 35 psi 2%B(0min~0.8 min)， 24%B(3.0 min~4.0 min)， 100%B (6.0 min~7.9min)， 2%B(7.9min~8.0min) 4.2MRM 参数 表-1.3种呕吐毒素的串联质谱检测参数 化合物 (min) 定量离子对(碰撞能量eV、锥孔电压 eV) 定性离子(碰撞能量eV、锥孔电压 eV) DON 4.30 297>249(10，20) 297>203(16，10) 3-ADON 5.71 339>231(13，17) 339>203(13，17) 15-ADON 5.84 339>137(9，18) 339>321(7，18) 5.实验数据 5.1实际样品进行加标回收的实验数据： 空白大麦粉中添加水平为 500 ug/kg 的3种呕吐毒素的回收率结果测试，三三种呕吐毒素的回收率均在84.0-93.4%之间， RSD 值在2.2-8.0%。 表-2.添加水平为 500 pg /kg 大麦粉中的回收率结果 名称 1 回收率(%) 2 3 平均回收率(%) RSD(%) DON 85.3 95.0 100.0 93.4 8.0 3-ADON 80.0 87.0 85.0 84.0 4.3 15-ADON 90.0 92.3 94.0 92.1 2.2 玉米类谷物中添加水平为200 ug/kg 的3种呕吐毒素的回收率结果测试，回收率在 87.7-94.9%， RSD值为2.9-5.1%，能够非常完美地运用于呕吐毒素的净化。 表-3.添加水平为200 pg /kg 玉米粉的回收率结果 名称 1 回收率(%) 2 3 平均回收率(%) RSD(%) DON 85.3 90.3 87.4 87.7 2.9 3-ADON 93.0 94.2 97.4 94.9 2.4 15-ADON 94.0 98.0 104.0 98.7 5.1 6.1谷物进行分析时，由于样品中呕吐毒素含量往往较高，故需要对固相萃取的样品通道进行清洗，以免交叉污染。 Fotector Plus 带有自动清洗样品通道和样品瓶功能，能够为实验人员节省大量时间。 6.2谷物中离心完成后，不可放置过长时间，否则谷物容易重新吸水，导致提取液的浓度过高，导致样品的回收率偏高，影响测试结果。 6.3淋洗溶剂对回收率的有一定影响，应以5 mL 的 PBS缓冲液和5mL 的纯水除去免疫亲和柱上残留的色素和基质，以免液质检测时产生基质抑制。若不进行纯水淋洗，3平行样品平行性明显降低， RSD 值将大于10%。 6.4洗脱速度与洗脱量的影响，洗脱量以2 mL为宜。若以1mL 的溶剂量进行洗脱，可能导致化合物回收率在50-100%之间波动，特别对于高浓度样品(500g/kg)， 回收率在40%以下。 本方法可实现呕吐毒素样品提取到净化整个前处理过程自动化，提取时，只需将称取完的样品及量取溶剂放置于离心管中，通过 AH-30全自动均质器进行快速提取；样品提取液通过 Fotector Plus全自动固相萃取仪对其进行免疫亲和净化，通过柱插杠气推压力实现免疫亲和柱自动脱帽，告别人为脱帽以及实验室人员看守的烦恼，确保自动完成净化任务；净化后的洗脱液可直接放置 Auto EVA-60 浓缩仪进行平行浓缩，避免样品多次转移造成的损失，提高样品回收率，提升实验人员的工作效率；呕吐毒素标准中间液、使用液的配制以及替代物、内标物的添加，可通过 Auto Prep 200全自动液体样品处理工作站内置储存的方法，精准配制呕吐毒素的标准曲线，轻松解决实验人员配液难点问题，顺利完成配制任务。 全自动均质器样品提取 全自动固相萃取仪样品净化 全自动浓缩仪样品浓缩 全自动液体样品处理工作站标准溶液配制 邮箱： info@raykol.com热线：址：： www.raykol.com 网址：： www.raykol.com邮箱： info@raykol.com热线： 本应用文章参考GB 5009.111-2016《食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》中第二法，采用免疫亲和柱净化，高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）联用技术检测，建立了大麦粉及玉米粉基质中对呕吐毒素的前处理和检测分析方法，对于三种呕吐毒素的加标回收率在85-105 %之间。