水中19种磺胺类抗生素药物检测方案(固相萃取仪)

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Raykol Applications Collection-RKFT-W002 全自动固相萃取-高效液相色谱法串联质谱测定 水中19种磺胺类抗生素药物 磺胺类药物(Sulfonamides，SAs) 是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。SAs种类可达数千种，其中应用较广并具有一定疗效的就有几十种，常见的磺胺类药物见图-1。磺胺药是现代医学中常用的一类抗菌消炎药，其品种繁多，已成为一个庞大的“家族”了。但是磺胺药会引起人过敏性反应，且可能有致癌性，随着社会的发 展，磺胺类药物的不合理使用，使其在动物性食品中残留引起生态环境污染和人类健康危害的潜在威胁已备受关注，如存在的毒副作用，可使人产生脱敏性皮炎，肠胃问题，造血及肾脏损伤等，成为人类亟待解决的问题之一。养殖场及屠宰场的废水常含有高浓度的磺胺类药物残留，因此对于水质中磺胺的检测需求日益增大。 H2NH2NH2N H2N .H2NS=0 N _O N= H2NoN NHO磺胺醋酰 磺胺嘧啶 磺胺噻唑 磺胺吡啶 磺胺甲基嘧啶 甲氧卞啶(TMP)H2N H2N、 H2N、 H2N H2N、 OH CN N - 、 N = A IN-NS.C NO)NH SN ISO NH OH 磺胺6-甲氧基嘧啶 磺胺对甲氧嘧啶 磺胺甲氧哒嗪 磺胺氯哒嗪 磺胺间二甲氧嘧啶 磺胺邻二甲氧嘧啶 H2N H2N H2N、 H2N H2N、H2N、 0 N- H2N、N-o .O-NO- SO NN-NNON HH ON SH磺胺二甲嘧啶 磺胺甲噻二唑 磺胺甲基异噁唑 磺胺二甲噁唑 磺胺二甲氧基噁唑 磺胺噁啉 磺胺苯吡唑 图-1.19种磺胺类抗生素结构图 关键字：全自动固相萃取；高效液相色谱-串联质谱；磺胺抗生素 2.仪器和耗材 Raykol Fotector Plus 全自动固相萃取仪 HLB固相萃取柱(CNW， 200 mg/6mL) 高效液相色谱： (HPLC) Agilent 1260 质谱检测器：：： (MS)Agilent 6410 3.样品富集与净化 3.1固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 睿科Fotector Plus/AutoSPE 固相萃取柱 HLB (Waters， 60 mg/3 mL) 活化 甲醇 淋洗 pH=4.0的甲酸水溶液 洗脱 甲醇溶液 氮气吹干装置： Raykol AutoEVA-60全自动平行浓缩仪 甲醇，甲酸，氨水(优级纯) 3.2富集与净化过程 依次用甲醇(10mL)和水(10mL)以 5.0 mL/min的速率活化/平衡和淋洗固相萃取柱，备用。取纯净水样200 mL，加入EDTA-McIlvaine 缓冲溶剂(50mL， 0.1 mol/L) 调节水环境的 pH 为4.30左右，以5-7 mL/min 的速率经固相萃取小柱富集后；用甲酸水溶液(pH=4.0) 10 mL 以 10 mL/min 速率淋洗； 气推后用10 mL 的甲醇以1.0 mL/min 的速率洗脱。收集的样品在35℃， 5 psi条件下浓缩至近干，流动相乙乙-水溶液(10：90，v/v，11%甲酸)定容至 1.0mL， 供LC/MS-MS分析。详细的固相萃取流程见下图-2. No Step Source Output Flowe(mL/min)/Ter ℃) r4Volume(mL) Time G 1 Condition CH30H Waste2 20 5 0.5 2 Condition pH=4.0 formic... Waste1 10 5 0.T 3 Load sample Wastel 5 250 64.6 4 Rinse pH=4.0 formic... Waste1 20 10 0.8 5 Dry 14 6 Rinse Syringe CH30H 20 5 0.5 7 Elute CH30H Collect 1 10 10.3 8 Air push Collect 20 5 0.6 9 End 10 图-2. Fotector Plus 对水中磺胺类药物的固相萃取富集方法 4.检测条件 4.1色谱柱条件 柱子 流速 流动相 柱温 进样体积 检测器 离子模式 吹扫气 氮气温度 簇电压 雾化压力 梯度洗脱 Waters XBridge BEH HILIC 2.5 umx2.1 mmx50 mm 0.300 mL/min A： 10mM ammonium acetic (0.1% formic acid)， B： Methanol 35°C 10 uL Agilent 6410 ESI 11 L/min 350°C 4000 35psi 0.0-1.5 min， 93%的流动相A； 1.5-3.0 min， 60%的流动相 A； 3.0-3.5 min，10%的流动相A， 保持2 min； 5.50-6.0 min， 93%的流动相A； 6.00-10.0 min， 93%的流动相A. 4.2 MRM参数： 表-1.19种磺胺的串联质谱检测参数 Compound Name Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Energy Cell Accelerator Voltage 215 155.9 15 63 9 4 磺胺醋酰 108 15 63 17 4 251 185.1 15 103 13 4 磺胺嘧啶 156 15 103 9 磺胺噻唑 256 156 15 98 9 4 108.1 15 98 21 4 磺胺吡啶 250 184.1 15 107 13 4 Compound Name Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Energy Cell AcceleratorVoltage 155.9 15 107 13 4 265 172 15 102 13 4 磺胺甲基嘧啶 156 15 102 13 4 甲基苄胺 291 261.1 15 142 21 4 230.1 15 142 21 4 279 186 15 107 13 4 磺胺二甲基嘧啶 155.9 15 107 13 4 磺胺甲噻噁唑 271 156 15 88 9 4 108 15 88 21 4 磺胺对甲氧嘧啶 281.1 126 15 112 21 4 磺胺6-甲氧基嘧啶 281 215.1 15 117 13 4 156 15 117 13 4 磺胺甲氧哒嗪 281 156 15 107 13 4 108 15 107 25 4 磺胺氯哒嗪 285 156 15 98 9 4 108.1 15 98 21 4 磺胺间二甲氧基嘧啶 311.1 245.1 15 127 13 4 156 15 127 17 4 磺胺邻二甲氧基嘧啶 311 156 15 117 13 108 15 117 25 4 磺胺甲基异噁唑 254 156 15 103 13 147.1 15 103 9 4 磺胺二甲基噁唑 268.1 156 15 105 12 4 113.1 15 105 20 4 磺胺硝苯 336.1 294 15 130 10 4 198 15 130 17 4 4.3 MRM色谱图 下图为18种磺胺类化合物标准溶液(20ppb) 在液质中的色谱图： 5.方法可行性验证 为了验证该方法的回收率，本实验向纯净水(200mL)中加入上述19种磺胺类标准品(10uL，1 mg/L) 进行加标回收验证(n=4)。测试结果如表-2所示，19种磺胺的回收率在80.00-120.00%之间， 只有磺胺醋酰和甲基苄胺的回收率分别在 73.94%和75.07%。19种磺胺4平行样的相对标准偏差均控制在15%以内。说明该方法能够很好地运用于水样中19种磺胺类样品的检测。 表-2.19种磺胺的加标回收率及 RSD 值(50ng/L) 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 样品-1 样品-2 样品-3 样品-4 Average RSD(%) (Compound) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Sample-4 Recoveries(%) 磺胺醋酰 76.12 71.42 72.48 75.73 73.94 3.17 磺胺嘧啶 102.04 111.53 82.20 88.42 96.05 13.78 磺胺噻唑 88.06 106.16 86.27 84.85 91.33 10.92 磺胺吡啶 91.66 114.36 90.79 97.87 98.67 11.07 磺胺甲基嘧啶 90.51 116.31 92.22 96.55 98.90 12.02 甲基苄胺 69.17 84.20 75.14 71.76 75.07 8.74 磺胺二甲嘧啶 99.44 108.02 99.53 87.70 98.67 8.46 磺胺甲噻噁唑 114.98 117.08 117.74 112.59 115.60 2.01 磺胺对甲氧基嘧啶 102.96 117.69 94.35 96.66 102.92 10.20 磺胺邻甲氧嘧啶 102.96 117.69 90.61 86.66 99.48 14.06 化合物 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 回收率(%) 平均回收率 样品-1 样品-2 样品-3 样品-4 Average RSD (%) (Compound) Sample-1 Sample-2 Sample-3 Sample-4 Recoveries(%) 磺胺甲氧哒嗪 104.92 115.71 100.90 89.26 102.70 10.64 磺胺氯哒嗪 89.10 98.40 91.74 97.00 94.06 4.65 磺胺间二甲氧嘧啶 106.12 114.66 96.60 88.92 101.58 11.03 磺胺邻二甲氧嘧啶 106.12 114.66 96.60 88.92 101.58 11.03 磺胺甲基异噁唑 105.28 114.09 97.87 90.44 101.92 9.93 磺胺二甲基噁唑 110.83 121.61 96.63 90.43 104.88 13.39 磺胺二甲氧基噁唑 110.83 121.61 96.63 90.43 104.88 13.39 磺胺喹噁啉 101.33 118.79 96.63 96.81 103.39 10.15 磺胺苯吡唑 78.56 93.02 96.63 71.24 84.86 14.11 6.1对于磺胺类的两性化合物，在 pH=7.0左右时，主要以带负电荷的形式存在水溶液中，此时进行富集，固相小柱无法对目标物进行吸附。因此需要进行 pH调节至4.0左右，使其羧酸根部分不电离，增强其在固相萃取柱上的吸附能力。 7.仪器优势 睿科 Fotector Plus 全自动固相萃取仪能同时进行6个样品处理，自动连续处理60个以上样品，在处理大体积水样时，从活化、上样、淋洗到洗脱等多种基础命令，都由高精度注射射、12通阀、固定式上样针和柱插杆组合而成最短的流路系统，与自带补偿的软件相互配合，从而大大提高了仪器精度，保证了回收率。 6.2淋洗时采用甲酸酸化的水溶液，利于将固相萃取小柱中残留的 EDTA 除去，避免其在后续的洗脱液中干扰沙星类化合物的检测。 6.3氮吹浓缩过程中应控制吹至近干，不可过分干燥。 Auto EVA-60 平行浓缩仪可与睿科 FotectorPlus 全自动固相萃取仪完美兼容，即 Fotector Plus样品管可以直接移入进行浓缩氮吹，避免样品转移的麻烦和损失，其良好的平行性和浓缩效率、可控的氮气流量和氮吹针追随速度、便捷的软件操作等特点使得实验室样品的制备与浓缩更具有高效性与可靠性。 邮箱： info@raykol.com热线：址：： www.raykol.com 邮箱： info@raykol.com热线： SZDB/Z 323-2018 水产品养殖水中21种磺胺类、氯霉素类、四环素类、硝基呋喃类、喹诺酮类和孔雀石绿的测定高效液相色谱-串联质谱法