中药中化合物检测方案(液相色谱仪)

智能文字提取功能测试中

采用 Agilent 1200 系列蒸发光散射检测器分析中药 应用报告 生产 QA/QC 作者 徐智秀安捷伦科技公司 中国，上海 摘要 本应用报告报导了5种中药的HPLC分离方法，这些中药是浙贝母、知母、三金片、地肤子和路路通。对 HPLC 方法进行了分离优化，以得最最多的组分。还报导了样品制备方法，以便使读者能够遵循完整的方案。 Agilent Technologies 前言 2005版中国药典颁布了采用蒸发光散射检测器(ELSD) 分析中药的几种重要方法1。因为这些中药所含的化合物没有生色团或紫外吸收非常弱，需要用一种像ELSD 这样的通用检测器对中药中的这些化合物进行定量测定。另一篇应用报告报导了银杏叶和黄芪的ELSD 分析2，这是药典要求检测的两种中药。浙贝母、知母、三金片、地肤子和路路通是中国药典2005版要求用 ELSD 分析特定活性成分的其它中药。 分析方法的起始过程和定量部分已经在前面两篇应用报告中介绍过2.3，按照药典要求进行定量分析非常简单，只需要两个数据点，用这两点的对数得到校正曲线，即可定量。因此，在本应用报告中将不再涉及定量分析。本文将介绍分离结果，以及梯度和仪器参数。 由于中药相当复杂，二极管阵列检测器(DAD)和 ELSD 都不能独立检测出所有成分。在本研究中，将 DAD 和ELSD 串联，以最大限度地获得样品信息，并监测系统洗脱的所有色谱峰。使最大数量的色谱峰得到良好分离，还有助于用指纹图谱对其它未知组分进行分析。 分离采用的是 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱(RRLC)系统。在这个系统上，可以针对中药样品的不同分析需求，轻松 地选择使用亚2微米 RRLC色谱柱或常规HPLC柱。如果使用窄内径色谱柱，因为峰宽变窄， 需要 RRLC喷雾器(安捷伦部件号 G4218-20004)。本应用报告中报导的实例，兼顾了分离和样品通量两个因素。针对需要加快分离速度或提高峰容量的不同需要，也可以使用同样填料但内径和长度不同的其它色谱柱。 实验 标准品和材料 路路通酸、地肤子皂苷lc、羟基积雪草苷、知母皂甙元、贝母甲素和贝母乙素均购于国家药品和生物制品品定所(中国北京)。中药样品购自上海的中药店。 仪器 使用 Agilent 1200 系列高分离度快速液相色谱系统进行常规和 RRLC 方法开发。该系统包含以下组件： ( · Agilent 1200 系列 SL型二元泵，配置真空脱气机 ) · Agilent 1200 系列 SL型高效自动进样器 ( · Agilent 1200 系列 SL 型柱温箱 ) ( ·Agilent 1200 系列 SL型二极管阵列检测器 ， 配置微量 流 通池(2pL体积，3mm光程) ) ( ·Agilent 1200 系列蒸发光散射检测器，配置标准喷雾器 ) ( ·安捷伦化学工作站 B.03.02，用于数据采集和处理 ) 样品制备 路路通：精确称取 0.6g粉末置于样品瓶中，加入20 mL 脱水乙醇，称量混合物，并超声15分钟。冷却后，再精确称量。加脱水乙醇补充损失的溶剂，充分混合并过滤。精确量取 10 mL 滤液，蒸发至干燥。用脱水乙醇溶解残渣，定容至2mL。溶液用 0.22 pm尼龙滤膜过滤后，直接进样。 地肤子： 精确称取0.5g粉末置于样品瓶中，准确加入10 mL甲醇。精确称量混合物，放置过夜，并超声30分钟， 冷却后再称量。加甲醇补充损失的溶剂至最初重量，充分混合。溶液用0.22 pm 尼龙滤膜过滤后，直接进样。 三金片： 取2片研磨，去除糖衣，研至细粉。精确称取0.5g粉末置于样品瓶中，准确加入10mL甲醇。溶液超声30分钟，冷却，充分混合并过滤。然后准确量取5 mL 溶液，该溶液用氨水定量冲洗2次(次次0.5mL)。蒸干提取物，用甲醇溶解残渣，充分混合，配制成分析溶液。溶液用 0.22pm 尼龙滤膜过滤后，直接进样。 ( 知母： ) 精确称取样品粉末0.5g置具塞样品瓶中，准确加入10 mL乙醇，称重，并浸泡过夜。样品超声处理40分钟，冷却，再称重。用乙醇补充减失重量，并充分混合。然后，加入10mL水和1mL盐酸，回流加热 2小时。样品冷却后，边振摇边滴加40%氢氧化钠溶液，至溶液颜色由橘黄色骤变为橘红色。样品用氯仿萃取2次(每次5mL)。合并提取液，蒸发至干燥。用甲醇溶解残渣，并用甲醇稀释至最终体积5mL，充分混合。溶液用 0.22 pm 尼龙滤膜过滤后，直接进样。 浙贝母： 精确称取样品粉末2g置具塞样品瓶中，加入4mL浓氨水，浸泡1小时。准确加入20 mL 氯仿和甲醇混合物(4：1)。样品称重，在80℃水浴上回流加热2小时。样品冷却后，再称重，用上述混合物补充减失的溶剂。过滤样品，准确量取5mL滤液，在蒸发皿中蒸发至干燥。用甲醇溶解残渣，转移到样品瓶中，用甲醇稀释至最终体积10mL，充分混合。溶液用 0.22 pm 尼龙滤膜过滤后，直接进样。 ELSD 温度： 40C ELSD 压力： 50 psi 知母：ELSD增益： 9 色谱柱： Agilent ZORBAXELSD 过滤器： 3s Eclipse C18， 3 x50 mm， 1.8 pm地肤子： 溶剂 A=水(0.1%醋酸)，色谱柱： Agilent ZORBAX B=甲醇Eclipse C18， 4.6x 流速： 0.6 mL/min100 mm， 3.5 pm 梯度： 0分钟，45%B；5分钟，溶剂 A=水(0.1%醋酸)， 45 %B；10分钟，B=甲醇，等梯度， 80%B； 15分钟，90%B 100%B流速： 0.8 mL/min UV检测器： 210nm， 254 nmUV检测器： 210 nm， 254 nm ELSD 温度： 45℃ELSD 温度： 40°℃ ELSD 压力： 50 psiELSD 压力： 50 psi ELSD 增益： 9ELSD增益： 9 ELSD 过滤器： 3sELSD过滤器： 3s浙贝母：三金片： 色谱柱： Agilent ZORBAX色谱柱： Agilent ZORBAX Eclipse C18， 3x方法 Eclipse C18， 4.6 x 50 mm， 1.8 pm100 mm， 3.5 pm 溶剂 A=水(0.03%氨水，路路通：溶剂 A=水(0.1%醋酸)， pH9)， B=乙青色谱柱： Agilent ZORBAXB=甲醇 流速： 0.6 mL/minEclipse C18，流速： 0.6 mL/min 梯度： 0分钟，45%B；5分钟，4.6x150mm， 1.8 pm杉度： 0分钟， 45%B； 10分 45%B； 10分钟，溶剂： A=水(0.1%醋酸)，钟，55%B； 20分钟， 70 %BB=甲醇100%B UV检测器： 210 nm， 254 nm流速： 0.8 mL/minUV检测器： 210 nm， 254 nm ELSD 温度： 45℃梯度： 0分钟， 80%B； 10分ELSD温度： 40°℃ ELSD 压力： 50 psi钟， 85%B；30分钟，ELSD 压力： 50 psi ELSD增益： 9100%BELSD增益： 9 ELSD 过滤器： 3sUV检测器： 210 nm， 254 nmELSD 过滤器： 3s 结果和讨论 路路通 图1显示了 Fructus Liquidambaris (中文名，路路通)UV-254 nm 通道和ELSD 通道的色谱图。图1标出了路路通酸。比较两个通道的结果，可以看出其中的区别。路路通酸在 UV-254通道中没有响应，而对ELSD 有良好响应。分析之初洗脱出的其它组分在 ELSD 上没有响应，但254 nm 紫外检测有响应。这里没有显示210nm 通道的图谱，因为只有几个色谱峰，而且吸收值很低。 有2对色谱峰，分别标记为1和2。我们对这2对色谱峰的分离进行了优化，因为它们对 ELSD比 UV210 nm 的响应更强，将来有可能成为要用 ELSD 进行定量分析的潜在化合物，尽管我们还不知道它们的确切结构。 地肤子 图2显示了用ELSD 和 UV-210 nm 两个通道对地肤子分离组分的检测结果。图中标示为地肤子皂苷lc， 其在210nm 有非常弱的紫外吸收。用 ELSD 比 UV检则器检测到了更多的色谱峰，说明地肤子中的某些组分没有声色团，需要两个检测器串接，在一次分析中得到两个通道的信息。一些较早洗脱的组分没有声色团，只在ELSD 通道中有响应。 图1 路路通的ELSD检测(红色)色谱图和UV通道(蓝色)色谱图的叠加 图2 地肤子 ELSD 通道(红色)和UV210nm通道(蓝色)的色谱图 三金片 图3显示了三金片 ELSD 和 UV-210 nm通道分析的色谱图。标出了其活性成分，羟基积雪草苷。210 nm 的紫外吸收信号显示色谱峰比 ELSD 通道少，因为注入色谱柱的大多数组分都没有声色团。另外，210 nm 的UV信号基线不平坦，因为用于分离的溶剂的吸收在梯度变化过程中有所改变。如果没有 ELSD， 将不会得到三金片色谱峰的更多信息，也无法达到质量控制指纹图谱。 知母 ELSD 通道的色谱图显示，从中药店购得的知母质量不太好，因为知母皂甙元的峰很小。知母皂甙元在 210 nm 紫外检测波长下没有响应。对于知母的其它组分， ELSD通道检测到的比紫外210 nm通道的色谱峰更多，而且两张色谱图有差异。要得到知母中有声色团和没有声色团组分的更多信息，需要使用这两种互补的检测器。 图3 三金片 ELSD 通道(红色) 和 UV 210 nm通道(蓝色)的色谱图 图4 知母ELSD通道(红色) 和UV 210 nm通道(蓝色)的色谱图 浙贝母 贝母甲素和贝母乙素是浙贝母中两种最重要的成分。210 nm 紫外检测只有很少的几个色谱峰。ELSD 检测结果显示，两种活性组分得到了良好分离，用亚2微米色谱柱在Agilent 1200系列 RRLC 系统上，只用12分钟即可完成分离。用现在的方法，这两种组分可以完全分离。如果峰容量不是问题， 可以用 Agilent 1200 系列 RRLC系统加快分析速度，得到更高的样品通量。 结论 在本应用报告和以前的应用报告2中， 我们建立了中国药典2005版要求用 ELSD检测中药的分析方法。探讨了各种样品的制备方法和仪器参数。 ELSD 是分析不含声色团化合物的最佳选择。当化合物在紫外区没有良好紫外吸收的官能团时， ELSD 可以提供更好的信号。当流动相采用有 UV 吸收的溶剂时， ELSD还可以保持基线平稳。 将UV 和 ELSD 串接进行检测非常必要，可以获得两个通道的信号，因为任何一种检测器单独使用都不能检测到所有的色谱峰。本应用报告所报导的方法可以用于质量控制部门，因为这里提供了详细信息。 图5 浙贝母ELSD 通道(红色) 和UV 210nm通道(蓝色)的色谱图 参考文献 1. Pharmacopoeia of the People’sRepublic of China，volume 1， ChinaPharmacopoeia Commission， People’sMedical Publishing House， 2005. 2. Z. Xu，"Analysis of traditional Chinesemedicines with the Agilent 1200 Seriesevaporative light scattering detector，"Agilent Technologies Application Note，publication number 5989-8922EN，2008. 3. ( Z. Xu， H. Huang， X . Zhang， " A nalysis ofRadix Bupleuri ( Chaihu) using A gilent1200 Series L C Systems with Evaporative Light Scattering Detector，"Agilent Technologies Application Note， publication number 5989-9834EN，2008. ) www.agilent.com/chem/elsd @安捷伦科技公司，2009 2009年1月1日印刷 出版号5990-3412CHCN Agilent Technologies 由于中药相当复杂，二极管阵列检测器（DAD）和ELSD都不能独立检测出所有成分。在本研究中，将DAD和ELSD串联，以zui大限度地获得样品信息，并监测系统洗脱的所有色谱峰。使zui大数量的色谱峰得到良好分离，还有助于用指纹图谱对其它未知组分进行分析。分离采用的是Agilent 1200系列高分离度快速液相色谱（RRLC）系统。在这个系统上，可以针对中药样品的不同分析需求，轻松地选择使用亚2微米RRLC色谱柱或常规HPLC柱。如果使用窄内径色谱柱，因为峰宽变窄，需要RRLC喷雾器（安捷伦部件号G4218-20004）。本应用报告中报导的实例，兼顾了分离和样品通量两个因素。针对需要加快分离速度或提高峰容量的不同需要，也可以使用同样填料但内径和长度不同的其它色谱柱。