莲子中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2检测方案(液相色谱仪)

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2351 黄曲霉毒素测定法 第一法 本法系用高效液相色谱法（通则0512）测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（黄曲霉毒素B1 、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2 总量计），除另有规定外，按下列方法测定。 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-水（40：18：42）为流动相；采用柱后衍生法检测，①碘衍生法：衍生溶液为0.05%的碘溶液（取碘0.5g，加入甲醇100ml使溶解，用水稀释至1000ml制成），衍生化泵流速每分钟0.3ml，衍生化温度70℃； ②光化学衍生法：光化学衍生器（254nm）；以荧光检测器检测，激发波长λex = 360nm （或365nm），发射波长λex = 450nm。两个相邻色谱峰的分离度应大于1.5。 混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1 、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2 标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。精密量取贮备溶液1ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。 供试品溶液的制备 取供试品粉末约15g（过二号筛），精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3g，精密加入70%甲醇溶液75ml，高速搅拌2分钟（搅拌速度大于11000转/分钟），离心5分钟（离心速度2500转/分钟），精密量取上清液15ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，量取续滤液20.0ml，通过免疫亲合柱，流速每分钟3ml，用水20ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。 测定法 分别精密吸取上述混合对照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液20～25μl，注入液相色谱仪，测定峰面积， 从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1 、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2 的量，计算，即得。 第二法 本法系用高效液相色谱-串联质谱法测定药材、饮片及制剂中的黄曲霉毒素（以黄曲霉毒素B1 、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2 总量计），除另有规定外，按下列方法测定。 色谱、质谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以10mmol/L醋酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B；柱温25℃；流速每分钟0.3ml；按下表中的规定进行梯度洗脱。 以三重四极杆串联质谱仪检测；电喷雾离子源（ESI），采集模式为正离子模式；各化合物监测离子对和碰撞电压（CE）见下表。 系列混合对照品溶液的制备 精密量取黄曲霉毒素混合对照品溶液（黄曲霉毒素B1 、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2 的标示浓度分别为1.0μg/ml、0.3μg/ml、1.0μg/ml、0.3μg/ml）适量，用70%甲醇稀释成含黄曲霉毒素B2、G2浓度为0.04～3ng/ml，含黄曲霉毒素B1、G1浓度为0.12～10ng/ml的系列对照品溶液，即得（必要时可根据样品实际情况，制备系列基质对照品溶液）。 供试品溶液的制备 同第一法。 测定法 精密吸取上述系列对照品溶液各5μl，注入高效液相色谱-质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线。另精密吸取上述供试品溶液5μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1和黄曲霉毒素G2的浓度，计算，即得。 【附注】 （1）本实验应有相应的安全、防护措施，并不得污染环境。 （2）残留有黄曲霉毒素的废液或废渣的玻璃器皿，应置于专用贮存容器（装有10%次氯酸钠溶液）内，浸泡24小时以上，再用清水将玻璃器皿冲洗干净。 （3）当测定结果超出限度时，采用第二法进行确认。 《中国药典》对部分中药材中AFB1的限量规定为5µg/kg,黄曲霉毒素总限量为10µg/kg。目前来讲，黄曲霉毒素AFT的检测方法有高效液相色谱法(HPLC)，酶联免疫检测法等。液相色谱法可以精确的检测中药材中黄曲霉毒素的微小含量。而使用黄曲霉毒素 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素残留。普瑞邦作为国内专业从事霉菌毒素检测技术与产品服务的供应商，普瑞邦检测应用实验室重点关注食品安全事件尤其是涉及霉菌毒素安全等问题，针对上述情况,提出了以下解决方案。免疫亲和柱＋KRC光化学柱后衍生法1. 简介PriboFast黄曲霉毒素B+G免疫亲和柱（编号IAC-010-3）可选择性吸附样品液中的毒素，从而对毒素样品起到非常针对性的纯化作用，然后用HPLC/FLD＋KRC柱后衍生系统可以有效的测定黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、浓度，提高检测的准确性和灵敏度。2. 免疫亲和柱/KRC衍生法特点：• 采用高特异性的抗体。• 柱容量高、柱体积大，稳定的纯化效率；• 柱内胶含量高，保证稳定的回收率；• 符合国内外限量标准• 纯化后直接用于ELISA 法，高效液相色谱法，荧光光度法等。• 适用于各种复杂基质样品处理• 衍生化操作方便，光化学衍生化无需使用衍生试剂（通常电化学柱后衍生均需要使用衍生试剂，分析成本高，操作麻烦，仪器故障率较高）。• 回收率高，达到90％以上3. 免疫亲和柱法操作步骤简介：1）样品处理•准确称取25g粉状样品，溶于125ml甲醇/水（70/30）中；.加入5.0g氯化钠以均质器高速搅拌，提取2分钟；.4000r/min离心5min或用槽纹滤纸过滤；.取15mL滤液并加入30mL水稀释，用玻璃微纤维滤纸过滤；.取稀释后液体待测；.将免疫亲和柱连接于20.0mL玻璃注射器下。准确移取15.0mL样品提取液注入玻璃注射器；.将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2~3mL空气通过柱体；.以10.0mL水淋洗柱子2次，弃去全部流出液，并使2mL~3mL空气通过柱体；.准确加入1.0mL色谱级甲醇洗脱，流速为1 mL/min ~2mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。•2）测定：HPLC直接进样，经黄曲霉毒素专用色谱柱、KRC光化学柱后衍生化后荧光检测器直接记录并计算出黄曲霉毒素B1B2G1G2浓度；Pribofast KRC 柱后衍生器和 HPLC参数（符合GB23212-2008）PriboFast KRC－25 柱后光化学衍生器 紫外灯波长：254 nmHPLC-色谱柱 ：黄曲霉毒素专用色谱柱 150 x 4.6 mm; C-18流 动 相 ：甲醇-水 45:55流 量 ： 1.0 mL/min柱 温 ： 35 °C进 样 体 积 ： 20μL荧光检测器 ： λ-激发波长：365nm λ-发射波长：455 nm液相色谱仪检测配置；高效液相色谱仪带有荧光检测器；Pribofast KRC－25 柱后光化学衍生装置，配有纳米灯管254nm，25米FTFE线圈。黄曲霉毒素专用色谱柱 C18 150 x 4.6 mm