大西洋鲑与虹鳟中品种鉴别检测方案(生物质谱)

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SSL-CA14-963Excellence in Science Excellence in ScienceMultiNA-024 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center上海市徐汇区宜州路180号华鑫天地二期C801栋 咨询电话：021-34193996 http：//www.shimadzu.com.cnBuilding C801， No.180 Yizhou Road， Shanghai Hotline： 021-34193996 应用微芯片电泳 MultiNA结合PCR法鉴别大西洋鲑与虹鳟 MultiNA-024 摘要：本文利用动物基因组 DNA 抽提试剂盒提取大西洋鲑和虹蹲的基因组 DNA， 设计品种特异性引物进行PCR扩增，应用微芯片电泳仪 MultiNA 检测扩增产物，结果显示大西洋鲑和虹的引物分别只对本品种的基因组有响应，电泳凝胶图上显示出与理论尺寸相符的特异性条带，而对另外一个品种则无响应。本实验表明基于微芯片电泳泳 MultiNA 开发的方法可以快速实现大西洋鲑和虹鳟的鉴别。 关键词： MultiNA PCR 品种鉴定大西洋鲑虹鳟 三文鱼是“Salmon”的音译，原本指鲑属的大西洋鲑鱼 (Salmo salar) (见表1)，为海水鱼。随着养殖业的发展，部分商家也将太平洋鲑等鱼类当作“三文鱼”进行出售，如虹鲜。虹(Oncorhynchusmykiss) ，是鲑科太平洋鲑属(又称大麻哈鱼属)的一种(见表1)，多为淡水养殖，直接生食可能为人体健康带来潜在风险。大西洋鲑和虹鲜的鱼肉组 织外观相似，难以通过感官识别准确区分，需要开发更加特异可靠的方法进行品种鉴别。 为此，这里应用PCR方法，结合岛津自动化高分辨率的微芯片电泳仪 MultiNA对大西洋鲑和虹鲜进行了鉴定。此方法操作简单，特异性高，，l可快速实现食品品种的鉴定。 表1大西洋鲑与虹鲜的科属种生物分类 名称 科 属 种 大西洋鲑 Salmonidae (鲑科) Salmo (鲑属) Salmo salar (大西洋鲑) 虹鳟 Salmonidae(鲑科) Oncorhynchus (太平洋鲑属) Oncorhynchus mykiss (虹) 实验部分 1.1仪器 微芯片电泳仪 MultiNA 1.2试剂 动物基因组 DNA 抽提试剂盒(碧云天， D0065S) SYBR Premix Ex Taq TMⅡI (宝生物工程有限公司，RR820A) SYBR@ Gold Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen， S-11494) DNA-500 Reagent Kit for MultiNA (Shimadzu， 292-27910-91) 25 bp DNA Ladder (Invitrogen， 10597-011) 样品：大西洋鲑鱼、虹鳞鱼的鱼肉组织 引物：根据线粒体细胞色素C氧化酶亚基|基因 (COI)分别设计大西洋鲑鱼与虹鱼的特异性引物，理论产物大小分别为243 bp 和314 bp。 1.3分析条件 DNA-500 on-chip. 1.4实验方法 取少量鱼肉组织，剪碎后采用动物基因组 DNA 抽提试剂盒提取 DNA， 利用两种品种特异性引物分别进行PCR扩增反应，PCR反应体系及反应条件分别见表2及表3。PCR产物进产微芯片电泳仪 MultiNA 进行测定。根据理论产物片段大小，扩增产物选用 DNA-500 的试剂盒进行测定。 表 2 PCR 反应体系 反应试剂 使用量(uL) SYBR Premix ExTaqI (2×) 10 PCR Forward Primer (10 uM) 0.8 PCR Reverse Primer (10 pM) 0.8 模板(消化产物) 0.2 dH，O (灭菌蒸馏水) 8.2 总体积 20 表3PCR反应条件 作用 温度/℃ 时间 预变性 95 30s 扩增 1((30个循环) 变性 94 30s 退火 59 30 s 延伸 72 45s 循环后延伸 72 5 min I结果讨论 使用品种特异性引物进行 PCR扩增后，应用微芯片电泳 MultiNA 对扩增产物进行检测，检测结果见图1。由图可知，使用大西洋鲑特异性引物对样品进行 PCR扩增和电泳检测后，大西洋鲑检测到明显条带，尺寸为244 bp， 与理论值243 bp相符(方法误差为±5%)，而虹鲜无扩增条带，验证了引物的特异性；同样，使用虹鲜特异性引物对样品进行检测，虹虫样品在凝胶图上有显著条带，电泳图显示出319 bp的信号峰，与理论值314 bp相符，而大西洋鲑对虹引引物则无响应。以上说明利用两种品种特异性引物，成功鉴别大西洋鲑与虹鲜。 将大西洋鲑与虹样品进行人为掺混，使用两种引物的混合引物进行检测，同时检测到了大西洋鲑与虹鲜的信号峰，说明该方法可以同时实现大西洋鲑与虹鲜的鉴别。 图1微芯片电泳 MultiNA检测扩增产物的结果 注： L： ladder； 1：大西洋鲑引物+大西洋鲑样八；2：大西洋鲑引物+虹样品；3：大西洋鲑引物+水； 4：虹鳟引物+虹鳝样品；5：虹引物+大西洋鲑样品；6：虹鲜引物+水；7：大西洋鲑、虹虹的混合引物扩增大西洋鲑、虹的混合样品。 ■结论 本文基于分子生物学技术，采用岛津公司微芯片电泳仪 MultiNA 成功建立了鉴别大西洋鲑和虹工的方法。此方法高效、灵敏、检测特异性高、操作简便，是市场上易混淆三文鱼品种的鉴别利器。 本文利用动物基因组DNA抽提试剂盒提取大西洋鲑和虹鳟的基因组DNA，设计品种特异性引物进行PCR扩增，应用微芯片电泳仪MultiNA检测扩增产物，结果显示大西洋鲑和虹鳟的引物分别只对本品种的基因组有响应，电泳凝胶图上显示出与理论尺寸相符的特异性条带，而对另外一个品种则无响应。本实验表明基于微芯片电泳仪MultiNA开发的方法可以快速实现大西洋鲑和虹鳟的鉴别。