苹果汁中展青霉素检测方案(液相色谱仪)

智能文字提取功能测试中

结果和讨论009536CHN_01 应 用 报 告 UHPLC 作者 Padmaja Prabhu PerkinElmer， Inc. Shelton， CT 06484 USA 利用 Flexar FX-15UHPLC-UV 分析苹果汁中的真菌毒素--——展青霉素 简介 展青霉素由各种霉菌产生，主要感染苹果发霉部位。去除水果发霉和受损的部分可能无法消除所有的展青霉素，因为部分展青霉素可能会转移到健康的果肉部分。此外，水果内部可能会产生展青霉素，即使其并无明显的发霉现象。如 果用发霉的苹果生产苹果汁，展青霉素会进入果汁中。展青霉素不会被巴氏灭菌等热处理破坏。。展青霉素是一种天然的人体毒素，因此可在发育中的胎儿、免疫系统和神经系统等细胞内产生遗传影响。建议的指导水平是 50pg 展青霉素/kg 苹果汁[十亿分之五十(ppb)]。1羟甲基糠醛(HMF)，也称为5-(羟甲基)糠醛，是一种糖类脱水产生的有机化合物。HMF 已在各种热加工食品中被鉴定出来， 包括牛奶、果汁、烈酒、蜂蜜等。2 图1.展青霉素的结构和性质。 本应用报告将展示利用高效液相色谱和紫外检测器检测快速鉴定和定量苹果汁中展青霉素的方法。除了方法优化和标准品分析外，还分析了许多用于展青霉素测定的苹果汁样品。样品随机选自孟买当地市场。 展青霉素是一种无色至白色结晶固体。该物质易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯或乙酸戊酯，难溶于乙醚和苯。 实验 此应用中采用了 PerkinElmer FlexarTM FX-15 超高效液相色谱仪(UHPLC)，并配备了波长可编程的紫外-可见检测器。表1列出了UHPLC 的详细操作参数和果汁中展青霉素的提取过程。采用 PerkinElmer Chromera@数据系统完成仪器交互、数据分析和报告。 表1.用于测定展青霉素的详细仪器条件。 仪器 Flexar FX-15 高效液相色谱仪 分析柱 BrownleeTM DB AQ C18 1.9um× 100×2.1mm分析柱 柱温 35°C 流速 0.5 mL/min 流动相A pH 值4.0的醋酸水溶液 流动相B 水：乙腈((50：50) 进样量 25 uL 波长 275nm 提取程序 10mL 苹果汁+用乙酸乙酯提取的三 次提取物，将三次提取物混合并添加 4g硫酸钠。25mL提取物氮吹至干。 残留物溶溶 300uL 流动相A 中，待 注入色谱系统。 展青霉素的储备液：在乙酸乙酯中制备 200pg/mL 的展青霉素。 HMF储备液：在乙酸乙酯中制备 200pg/mL 的 HMF储备液。 标准溶液：分别取 100pL的展青霉素和 HMF 储备液在 10mL的烧瓶里蒸干，然后将残留物溶解在流动相A中，从而获得了浓度为 2ug/mL 展青霉素和 HMF 混合标准溶液。 加标溶液制备：取250pL 的展青霉素储备溶液氮气吹干，然后将残留物溶解在流动相A中，从而获得浓度为 5ug/mL展青霉素溶液。 校准曲线：将不同体积的 5ug/mL 展青霉素溶液加入10mL果汁样品中以获得以下校准曲线(表2)。 表2.校准曲线(六个点)1 创建方案。 校准水平 果汁体积 添加的标准 最终展青霉素 (mL) 溶液(uL) 浓度 (ppb) 1 10 20 10 2 10 40 20 3 10 80 40 4 10 100 50 5 10 160 80 6 10 200 100 校准：采用紫外检测器在10 至100ng/mL的范围内建立了校准曲线；各个校准点均进行两次试验以证明系统的精密度。展青霉素线性回归线的平均测定系数为0.998。展青霉素的校准曲线如图3所示。系统在校准范围内拥有出色的精密度。标准物质分析的色谱图如图4所示。 样品制备：样品选自孟买当地市场。样品包括苹果汁和苹果浓缩果汁。所有样品在分析前冷藏保存。将 10mL果汁样品移入50mL 试管中。用 10mL 乙酸乙酯提取果汁三次。将三次提取物混合并加入4g硫酸钠以去除水分。然后氮吹 25mL乙酸乙酯层至干。然后在 300uL 流动相A中使残留物溶解，通过Millipore@0.2um 尼龙66针筒滤膜过滤， 25pL注入色谱系统。 方法验证 图4.展青霉素色谱图实例。 利用 35、50、75ug/L这3种不同浓度水平下的加标果汁样品测试了此方法的回收率。测得数值分别为32.53、47.49、63.15ug/L， 证明该技术适用于定量分析含含水基质中提取的展青霉素。 在5.0和 10ppb的浓度下测量了方法的精密度。10ppb 以下精密度下降表明此方法的检测限检近 5ppb (表3)。 结果 利用本应用中所开发方法分析了三份苹果汁样品和一份浓缩果汁样品。 表3.检测限和定量限水平时的 RSD 值。 序号 展青霉素 展青霉素 展青霉素 展青霉素 浓度 面积 浓度 面积 (ppb) (ppb) 1 5 14894.7 10 41189.2 2 5 18836.3 10 44147.4 3 25627.5 10 45305.8 4 5 33795.2 10 44107.4 5 30614 10 39631.3 6 30640.4 10 43282.5 平均值 25734.6 42943.9 标准偏差 7455.87 2123.57 %RSD 28.97 4.94 样品编号 样品详情 展青霉素含量 (ppb) 样品1 果汁T N.D. 样品2 果汁S N.D. 样品3 果汁R N.D. 样品4 苹果浓缩果汁 N.D. 方法验证实验汇总 线性： 10.0ppb到 100ppb 的展青霉素 重复分析的 RSD： 4.94% (10.0ppb) 检测限： 5.0ppb 定量限：10.0ppb 回收率研究：在三个水平下所有样品的回收率介于 80.52-109.48%之间 图5.样品中展青霉素峰色谱图。 本应用展示了一种测定苹果汁中展青霉素的方法。此方法使用BrownleeTM DB AQ C18 1.9um×100×2.1mm分析柱，并以pH 值4.0的醋酸水溶液作为流动相，流速为 0.5mL/min。通常 HMF 的洗脱与展青霉素非常接近，因此方法中需要证明展青霉素和 HMF 的分离。用乙酸乙酯提取展青霉素，用硫酸钠处理提取物以去除水分。此步骤十分重要，因为当含水的乙酸乙酯蒸干时可能会破坏展青霉素。3此外，在40℃的低温条件下蒸发乙酸乙酯层，因为乙酸乙酯中的展青霉素在高温下不稳定。 或者使用经验证的 BrownleeAQ C18 100×2.1mm×3.0um色谱柱，在流速为 0.7mL/min 的情况下分离展青霉素和HMF， 取得相同的分离度。 采用上述方法对从市场上采集的样品进行了分析，并测定了样品中展青霉素的含量。所有果汁样品中的含量都小于 5pg/L。在不同水平的果汁基质中对此方法进行了验证，测得回收率值介于80.52-109.48%之间。 ( 参考文献 ) ( 1 . Guidance on t h e control o f patulin i n directly p ressedapple juice， http：//www.newark-sherwooddc.gov.uk/ ppimageupload. ) 2. Wikipedia. ( 3. AOAC Official M ethod 995.10， Pa t ulin in Apple Juice，Liquid Chromatographic Method. ) ( 4. Journal of AOAC I n ternational， V ol. 90， No. 3 ，879-883. ) 珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司 地址：上海张江高科技技区张衡路1670号邮编：201203电话：021-60645888传真：021-60645999 www.perkinelmer.com.cn PerkinElmer 有关我公司完整的全球办事处设立情况，请访问www.perkinelmer.com/ContactUs 版权 C2011， PerkinElmer， Inc. 版权所有。 PerkinElmer是 PerkinElmer， Inc. 的注册商标。其他所有商标均为其各自持有者或所有者的财产。 本应用报告将展示利用高效液相色谱和紫外检测器检测快速鉴定和定量苹果汁中展青霉素的方法。除了方法优化和标准品分析外，还分析了许多用于展青霉素测定的苹果汁样品。