人参中四种有机农药检测方案(研磨机)

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人参研究 GINSENG RESEARCH 2017年第1期·18· 施晓宇等：高分辨液相色谱串联质谱法测定人参中的四种有机磷农药·19 · 高分辨液相色谱串联质谱法测定人参中四种有机磷农药 施晓宇，苏 蕊* (长春中医药大学，吉林省人参科学研究院·吉林长春·130117) 摘 要：目的以传统中药材人参为研究对象，建立高分辨液相色谱串联质谱法(UPLC/ESI Q-Orbitrap)对人参中四种有机磷农药丁嘧硫磷、二嗪农、甲基嘧啶磷、克百威进行定性和定量分析。方法应用QuEChERS 方法从人参样品中提取残留农药，UPLC/ESI Q-Orbitrap MS 全扫描模式(full scan)下，获得 MS 数据，用于定性分析。UPLC/ESI Q-Orbitrap dd-MS2 扫描，获得的待测目标化合物的离子碎片谱图，用于进一步验证有机磷农药。在 UPLC/ESI Q-Orbitrap MS 的 t-SIM 模式下获得定量分析的数据，用于四种有机磷农药残留的定量分析。同时，进行方法学验证，测定检出限，定量限及加标回收率结果两种不同产地人参样品加标回收率为 83.5%~98.4%；RSD 为1.56%~9.87%；检出限为0.87~1.14uug/L。结论本方法具有简便、快速、灵敏度高等特点，适用于人参中残留农药的定性、定量分析。 关键词：有机磷农药；人参；UPLC/ESI Q-Orbitrap MS UPLC/ESI Q-Orbitrap detect four organophosphoruspesticides in Ginseng SHI Xiao-yu， SU Rui* (Changchun University of Chinese Medicine， Changchun 130117， China) Abstract：Objective Taking traditional Chinese medicinal ginseng as the object of this study. A high-resolutionliquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC/ESI Q-Orbitrap) method was established toanalysis of four organophosphorus pesticides residues in Ginseng. Four organophosphorus pesticidesused in this study， including tebupirimfos， diazinon， pirimiphos methyl and Carbofuran. Method Thepesticides are extracted from the ginseng samples by the QuEChERS procedure. The MS data forqualitative analysis were obtained by UPLC/ESI Q-Orbitrap MS’full scan mode. The ion fragmentationspectra of the unidentified target compounds for a further confirmation of the organophosphoruspesticides were obtained by UPLC/ESI Q-Orbitrap dd-MS2 scan mode. In UPLC/ESI Q-Orbitrap MS't-SIM mode， the quantification analysis’data for the quantification analysis of the four kinds oforganophosphorus pesticides’ residue were obtained. Meanwhile， some parameters including therecoveries， LOD and LOQ were calculated. Results The recoveries of method are from 83.5 to 98.4%；RSD of the recoveries is form 1.56 to 9.87%， and the limit detection is form 0.87 to 1.14 ug/L.Conclusion The method has the advantage of simple， rapid and high sensitivity； suitable for qualitativeand quantitative analysis of pesticide residues in ginseng and other kinds of Chinese herbals. Keywords：ginseng； organophosphorus； pesticide residues； UPLC/ESI Q-OrbitrapMS； 中药在我国已经有五千多年的历史，我国现有药用植物11460种。人参(Panax ginseng C.A.Mey.)为五加科植物，别名棒槌、地精、神草，为我国传统名贵药材，被誉为百草之王，至今已有4000多年的历史，也是重要出口药材之一。人参作为名贵中药，具有大补元气、补脾益肺、安神益智等功效。人参作为防病治病 的良药已在世界范围内被广泛使用。目前野生药材远远满足不了市场需求，大部分人参都依赖于人工栽培。为保证人参质量和提高产量，在种植和存储过程中不可避免的要使用各种类型的农药，因此人参中农药的残留问题不容忽视。现在，农药残留已被列为出口药品检验的重要指标之一。《中国药典》2005年版 ( 作者简介：施晓宇，女，在读硕士，研究方向：中药化学。 ) ( *通讯作者：苏蕊，博士，助理研究员，主要从事复杂基质的质谱分析研究。E-mail：sranalchem@163.com. ) 一部已经制定了中药及其相关制剂中部分农药残留的检测方法，并作为这些中药材的必检项目之一。随着人们对健康的日益关注和进出口贸易的发展，农药残留分析方法的研究对人参中农药残留的检测具有重要意义。 有机磷农药是30年代末开发的第二代人工合成农药，种类繁多，具有高效、易分解等优点。多用于防治植物病、虫、害。但使用不当会对人体健康造成危害，其危害作用从剧毒到低毒不等。例如，有机磷农药能够抑制乙酰胆碱酯酶，使乙酰胆碱积聚，引起毒蕈碱样症状、烟碱样症状以及中枢神经系统症状，严重时可因肺水肿、脑水肿、呼吸麻痹而死亡。有机磷农药重度急性中毒者还会发生迟发性猝死。某些种类的有机磷中毒可在中毒后8~14天发生迟发性神经病，有机磷中毒者血胆碱酯酶活性降低。 2003年，Anastassiades 等首次报道了 QuEChERS(quick， easy， cheap， effective， rugged and safe) 方法。由于该方法能够快速、简便、高质量地对农药多残留进行分析，因此在水果、蔬菜、橄榄油及谷物等样品的农药多残留分析领域得到广泛应用。此方法的特点是对于固体样品，提取与净化过程可同时进行。 目前，人参中农药残留的检测技术主要有气相色谱法(连接氮磷检测器、热导池检测器、火焰光度检测器等)、液相色谱法16~81气相色谱-质谱技术11-51液相色谱-串联质谱技术9.10等。但一些热不稳定、强极性、低挥发性或易于吸附在气相色谱柱上的有机磷农药不适合采用气相色谱法分析。本文主要利用超高压液相色谱高分辨静电场轨道肼质谱仪对人参中四种有机磷农药残留(丁嘧硫磷、二嗪农、甲基嘧啶磷和克百威)进行定量分析，得到较好的分析结果。 1实验部分 1.1实验材料 UPLC/ESI Q-Orbitrap (Thermo，美国)；氮吹仪(HGC-12A，中国)；BEH C18色谱柱(Water，美国)；Geno/Grinder2010(SPEX SamplePrep，美国)；Allegra 6(Beckman Coulter Inc，美国)；粉碎机(荣浩RHP-600，中国)。 靖宇县人参；抚松县人参；乙腈(色谱纯，Fisher，美国)；乙酸(色谱纯，天津科密欧公司)；甲醇(色谱纯，Fisher，美国)；丁嘧硫磷；二嗪农；甲基嘧啶磷；克百威标准溶液(纯度>95%，购自 Dr.E公司)；丙酮(分析纯，北京化工厂，北京)；乙酸乙酯(分析纯，北京化工厂，北京)；ENVIRO CLEAN 萃取管；超纯水(Milli-pore，美国)；聚丙烯离心管(VWR，Canada)。 1.2实验方法 1.2.1色谱条件 色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH Ci8 柱 (1.7 um，2.1×100 mm)，UHPLC 流动相A 为乙腈，B为10 mmol/L；醋酸铵水溶液，柱温设定在35°℃，自动进样器的温度设定在5°℃，进样量为5pL，流速0.3mL/min，分离时间为8 min。色谱分离条件见表1. 表1 UPLC-ESI/Q-Orbitrap MS 的色谱分离条件 时间(min) 流速(uL/min) 流动相A(%) 流动相B(%) 0 300 20 80 7 300 95 5 9 300 20 80 11 300 20 80 1.2.2质谱条件 离子源为可加热的电喷雾离子源，Q-exactive 采用 MS-SIM 或 MS/dd-MS2 正极扫描模式，全扫描扫描范围为 m/z 65.0~500.0(0~7.0 min)，质量分辨率在为 70 000FWHM，AGC为 1.0E6，最大进样时间为250ms。应用全扫描 full mass scan 模式，得到定性分析数据，全MS/dd-MS2 扫描得到验证数据。四种有机磷农药质谱数据见表2么 表2四种农残的 UPLC/ESI Q-Orbitrap MS 参数 农药 英文名称 保留时间(min) 分子式 [M+H 丁嘧硫磷 tebupirimfos 4.65 Cj3H23N20PS 319.12398 二嗪农 Diazinon 5.42 C12H2N203PS 305.1082 甲基嘧啶磷 Pirimiphos-methyl 5.83 CH2N303PS 306.1034 克百威 Carbofuran 6.65 C12HI5NO3 222.1123 1.2.3标准溶液的制备 农药标准储备液：4000 pg/mL，溶解于色谱纯甲醇中。农药标准混合工作液浓度为10.0 ug/mL，储备液和标准工作溶液均储存在-20℃的冰箱中。移取一定量的10.0 pg/mL 的混合标准工作溶液于一定体积的甲醇中，得到所需浓度的混合标准溶液。 1.2.4试剂溶液的制备 乙腈/乙酸(99+1，V/V)的配制：990 mL 乙腈+10mL乙酸混合制成。 1.2.54种有机磷农残的QuEChERS 提取方法 准确确取15.0 g药材粉末于 50 mL 聚丙烯离心管中，然后加入0.1%乙酸乙腈，剧烈振荡45 s；向离心管内加入6.0 g无水硫酸镁和1.5g醋酸钠，再剧烈振摇1 min，盖好，以1 500 rpm 离心1 min，然后于 4℃下在3 500 rpm 离心3 min。取上清液7.0 mL 至ENVIRO CLEAN 萃取管(萃取管包括0.9 gMg-SO4，150 mgC 18，300 mgPSA)中，离心管盖好，用手摇晃45 s， 以 3 000 rpm 离心3 min。取上清液1.0 mL转移到5 mL玻璃品牌的离心管中，氮吹仪吹干，向其中加入 0.5 mL 甲醇，过 0.22 um 滤膜，所得溶液用UPLC/ESI Q-Orbitrap 进行检测。 2实验结果 2.1标准曲线、线性范围、检出限和定量下线 配制1.00、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00 pg/L的一系列不同浓度的标准样品，制备标准曲线，所得回归方程及参数如表3所示，色谱图见图1。由表3所得数据可知线性关系良好，检出限(LODs) 和定量下限(LOQs)分别为3倍和10倍 S/K。该实验的 LOD 范围是 0.87~1.14 ug/L，LOQ范围是2.70~3.98 pug/L。 图1四种农残的 UPLC/ESI Q-orbitrap 色谱图表3实验方法分析性能 农药 标准曲线 线性范围 LOD LOQ (ug/L) (ug/L) (ug/L) 丁嘧硫磷 A=594.21 c- 2-200 1.06 3.14 358.71 二嗪农 A=645.91c- 2-200 1.12 3.98 576.47 甲基嘧 A= 1314.63 2-200 0.87 2.70 啶磷 c-1603.19 克百威 A=1239.17 2-200 1.14 3.92 c-1268.16 2.2回收率 对于两种不同产地的人参样品进行加标。在最优的实验条件下每个样品平行分析5次，结果见表4。由表4可知，不同人参样品的加标回收率无明显差异，4种有机磷的加标回收率为 83.5%~98.4%，相对标准偏差 (RSD) 为 1.56%~9.87%。结果表明，本实验所提出的微波提取方法适用于提取人参中的有机磷农药。 表4两种不同产地人参样品的加标回收率 农药 加标浓度 样品1 样品2 (ug/L) 回收率(%) RSD(%) 回收率(%) RSD(%) 丁嘧硫 10 92.5 4.35 82.6 6.54 磷 50 89.6 2.89 95.7 5.33 二嗪农 10 95.1 7.89 84.1 9.87 50 87.9 1.56 83.6 4.98 甲基嘧 10 89.7 4.35 92.6 7.56 啶磷 50 98.4 2.98 94.5 4.09 克百威 10 89.9 9.25 83.5 4.69 50 90.3 3.50 84.7 2.20 3结论 本实验采用超高压液相色谱串联质谱法(UPLC/ESI Q-Orbitrap)， 将四种有机磷农药在 7 min 之内分离，同时采用 QuEChERS 提取方法将人参中待测有机磷农药提取出来，同时对分析方法进行方法学验证，考察方法的线性关系、定量限、检出限，并对市售的两种不同产地人参进行加标回收率测定。本方法证明 UPLC/ESI Q-Orbitrap 法具有简便、快速、灵敏度高且实用性强的特点，可用于中药材样品中的农药多残留痕量分析及常规检测，特别适用于检测人参中有机磷农药残留，也可为中药材的质量监控工作提供分析方法的依据。 ( 考 文南 献 ) ( [1]Wong， J. 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