大豆不同部位中4 种植物激素检测方案(气质联用仪)

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分析化学 (FENXI HUAXUE))研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry第12期1743~1749第42卷2014年12月 分析化学第42卷1744 DOI： 10.11895/j.issn.0253-3820.140705 在线固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时检测大豆不同部位的4种植物激素 贾鹏禹 曾明飞?冯乃杰 郑殿峰*1 孙福东' 孙蕊 李朝阳(黑龙江八一农垦大学，大庆163319) ?(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，上海201023) 摘 要 采用双三元液相色谱( Dual gradient liquid chromatography，DGLC)建立了在线固相萃取技术与电喷雾串联质谱联用方法(Online SPE DGLC-ESI MS/MS)，并成功应用于实际样品检测。本方法同时检测大豆不同部位中的4种酸碱性植物激素(赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)和脱落酸(ABA))。通过考察固相萃取富集柱、分析色谱柱、流动相对植物激素的保留和选择性的影响，获得较高的灵敏度、回收率、稳定性及精密度。大豆样品经液氮低温研磨，以80%甲醇溶液提取，再经离心稀释过滤后，进样分析。进样后样品经在线固相萃取 Hypersep Retain AX 柱洗脱保留，目标分析物依次转移至分析柱 Acclaim PA2 色谱柱，并以0.1%甲酸和甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，采用选择反应监测离子模式(SRM)同时采集正负离子通道进行定性分析，基质标准曲线外标法进行定量分析， GA3， IAA， ZT在0.1~50 ug/L 范围内线性良好，检出限为0.0002 pg/g； ABA 在0.5~50 ug/L的范围内线性良好，其检出限为0.0010 ug/g。以0.8， 4.0和40 ug/L分别为低、中、高浓度考察4种植物激素的回收率为 76.1%~93.5%，RSD 为0.8%~6.0%。结果表明，籽粒中含有的 ABA 浓度明显高于其它部位。本研究为快速准确地分离和测定大豆不同部位内源激素提供了有效方法。 关键词 内源植物激素；大豆；高效液相色谱-串联质谱；在线固相萃取技术 1 引 言 赤霉素(GA，)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)和脱落酸(ABA)是4种重要的植物内源激素，广泛分布在植物体内，对植物细胞的生长、分化、分裂、官建成成、植物的眠眠萌发形态反应等都有直接或间接的调节控制作用，参与植物生命的所有活动!1~3]。但是，内源激素因其在植物中的含量极低，基质干扰多，使得农作物内源激素的测定十分困难，因此痕量激素的测定技术已成为制约植物激素学界研究的最大瓶颈之一，同时也是分析科学领域的研究热点4。 目前，关于农作物中内源激素测定的文献报道多结合液相色谱技术或液相色谱-质谱联用技术，进样前几乎均采用固相萃取(SPE)技术去除农作物中复杂基质干扰。显然，固相萃取技术在复杂基体中痕量组分分析中处于核心地位，是农作物内源激素测定较为理想的选择15，6J。已发表的文献报道表明，其所采用的固相萃取方法处理过程基本上还处在手工操作阶段，存在过程复杂、耗材消耗量大、有毒试剂接触多、需要额外氮吹、重现性差、无法实现全自动联机和通量低等问题。本实验所采用的在线固相萃取技术是一种全自动的在线样品前处理方式，是近年来商品化的仪器样品前处理新技术。在线联接可避免因复杂前处理过程而带来的分析物损失，减少操作者因溶剂挥发与有毒溶剂的接触，节省时间，提高效率、可靠性和灵敏度，在线固相萃取分析越来越受到人们的重视17.8]。目前，在线固相萃取技术在农业科学领域的应用并不多见，因此本方法较已发表的关于测定植物激素的方法19，10]具有前处理简便、实验快速、灵敏度高等优点。植物激素包括生长素( Auxins)、赤霉素(Gibberellins)、细胞分裂素( Cytokinins)、脱落酸( Abscisic acids)和乙烯( Ethylene)五类，已发表的文献主要是考察其中某些酸性I或者碱性121的植物激素，缺乏全面性，本研究考察的4种植物激素 IAA， ZT， ABA 和 GA3，分别属于生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素。本方法有利于全面考察农作物中植物激素含量。 ( 2014-08-18收稿；2014-09-17接受 ) ( 本文系国家自然基金项目(Nos. 3117150331271652)、黑龙江省新世纪优秀人才培养计划资助项目(No. NCET-06-002)资助 *E - mail： zdffng@263. net ) 2实验部分 2.1 仪器与试剂 双三元液相色谱系统(美国赛默飞世尔科技有限公司)，配备 SRD3600 六通道真空脱气机，DGP3600 RS 双梯度快速分析型色谱泵(两个完全一致，同时又相互独立的三元泵，通过 Chromeleon 软件一体化控制)， WPS3000TSL 自动进样器，TCC-3000 柱温箱(配有两个六通阀)，Chromeleon 6.8变色龙色谱管理软件。质谱系统：TSQ Vantage 三重四极杆质谱系统，配有 Xcalibur 数据处理系统(美国赛默飞世尔科技有限公司)，离子源：HESI。 赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)和脱落酸(ABA)标准品(美国 Sigma-aldrich 有限公司)；乙腈、甲醇 (Optima 级，美国 Fisher 公司)，去离子水(18.2MΩ cm，Thermo 纯水机制备)。植株样品采自于黑龙江八一农垦大学作物实验基地(黑龙江省大庆市林甸县)，检测样品采用液氮冷冻后，用超低温冰箱保存。 2.2 样品处理 大豆检测样品(叶片、皮、籽粒)冷冻贮存于-80℃冰箱中。取1g样品，于液氮中研磨成粉末，转入6 mL 预冷的80%甲醇(含1mmol/L BHT)，于4℃下避光浸提12 h，于4℃下，以4000 r/min 离心 15 min， 分离上清液，沉淀物中加2 mL预冷的80%甲醇，再于4℃下浸提2h，离心，合并上清液，定容至10 mL，用去离子水1：1稀释，过0.22 uum 滤膜后，待测。 2.3 在线固相萃取和色谱分离条件 SPE Column：Thermo Hypersep Retain AX 柱(20 mmx3.0 mm，3um)， 左泵(Online SPE Pump)，流动相：甲醇(A)-水(B)。分析柱：Thermo Acclaim PA2 色谱柱(150 mm×2.1 mm，3um)，右泵(Analyti-cal Pump)，流动相：甲醇(A)-0.1% FA(B)；柱温：35℃，进样量：10 pL，六通阀切换程序及梯度淋洗条件见表1，Online SPE 流路见图1。 表1 LC-MS/MS泵梯度洗脱及阀切换程序 Table 1 LC-MS/MS pump gradient and valve switch position conditions for on-line SPE analysis 时间 流速 SPE 泵梯度比例 时间 分析泵梯度比例 切换时间 阀位置 Time (min) Flow rate (mL/min) SPE pump (Left) B% Time (min) Analytical1 (Right) pump B% Switch time (min) Valve position 0 1.0 90 0 90 0 1-2 4.0 1.0 90 6.0 90 5 6-1 5.0 1.0 80 8.0 10 9 1-2 6.0 1.0 20 13.0 10 13.0 1.0 20 13.1 90 13.1 1.0 90 15.0 90 15.0 1.0 90 Auto tune 模式：将1mg/L标准液通过蠕动泵连续进样。由 TSQ Tune 质谱参数优化软件自动获得最佳的子离子碰撞能量及透镜电压等，相应离子对与文献[11，12]相同，如图2所示。 选择反应监测(SRM)：针对二级质谱或多级质谱的某两级之间，即母离子选一个离子，碰撞后，从形成的子离子中也只选一个离子。因为两次都只选单离子，所以噪音和干扰被排除得更多，灵敏度和信噪比会更高，尤其对于复杂的、基质背景高的样品(见图)。 质谱条件：吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)采用正离子扫描方式、赤霉素(GA，)和脱落酸(ABA)采用负离子扫描方式，同时正负切换。 雾化温度：350℃，鞘气30 arb，辅助气：10 arb， Collision Gas Pressure：1.5 mTorr，离子传输管温度270℃，质谱扫描参数：扫描方式：SRM，扫描循环时间：0.8s，分辨率：Q1，Q3分辨率均设置为0.4 FWHM。具体的加热电喷雾电离(HESI)模式扫描条件件见表2。 A. 清洗位置 Wash position B. 上样位置 Load position 图1 Online SPE-dual-gradient liquid chromatography (DGLC)-MS 仪器流路图 Fig.1 Schematic diagram of online SPE-DGLC-MS system A. 清洗位置(Wash position)； B. 上样位置(Load position)。 图2 子离子全扫描质谱图 Zeatin (A)， IAA (B)， ABA(C) and GA3 (D) Fig.2 Full scan product ion spectra of Zeatin (A)， IAA (B)， ABA(C) and GA3(D) 表2 HESI 模式下的选择反应监测条件 Table 2 SRM conditions of analytes of LC-MS/MS in HESI mode 分析物 扫描模式 母离子 子离子 碰撞能量 透镜电压 S-lens 保留时间 Precursor Product Collision Retention Analyte Scan Mode ion (m/z) ion (m/z) energy (eV) (min) Zeatin， ZT Positive 220.124 136.056* 24 18 10.04 202.097 11.17 Indole acetic acid， IAA 176.106 130.079* 20 73 Positive 77.086 40 73 11.11 Abscisic acid， ABA Negative 263.111 153.143* 17 76 204.139 17 76 10.79 Gibberellic acid， GA3 Negative 345.115 143.127 40 239.179° 22 *定量离子对( Quantification Ion pairs) 3 结果与讨论 3.1 SPE 柱的选择 SPE 的分离保留机理有反相、正相、离子交换、体体排阻、免疫亲和等，GA，ABA IAA 的pK分别为 4.2，4.5，4.7，为酸性化合物； ZT的pK=11.4，为碱性化合物。现有的 SPE 方法多数只同时分析酸性111或者碱性的植物激素12，这样只能得到片面的结果。或者采用两次不同的 SPE (MAX、MCX)方式分别纯化酸性或碱性植物激素，最后合并净化后的样品113」，其涉及的前处理过程十分复杂，影响重现性等。本方法对 SPE 柱类型、上样流速、pH值、有机试剂等影响在线分析的主要因素进行了分析。 选先 TurboFlow MCX，TurboFlow MAX，AG19，Retain CX，Retain AX 进行比较。其中，TurboFlow 系列柱需要运用体积排阻、离子交换、反相保留的机理，上样速度一般要求2mL/min，以形成涡流，但在对4 种植物激素的保留过程中，始终无法同时保留，尤其是 GA3 在 TurboFlow 柱上始终在死时间直接被洗脱下来。AG19 是一种运用在离子色谱上的阴离子交换保护柱，对酸性化合物有较好的保留性能，但对上样溶剂的 pH值有一定的要求，只能用中性流动相上样，否则难以保留，这就与 MCX 的上样条件相冲突。考虑到通过在 Retain AX 是一种高纯度，高渗透的苯乙烯二乙烯基聚合物，通过键合季氨基增加对酸性化合物(GA，， ABA， IAA)的保留，同时具有一定的反相保留性能，可保留碱性化合物ZT。 流动相的选择对在线固相萃取具有显著影响，甲醇、乙腈是反相色谱中常用的有机试剂，本方法选择流动相主要是考虑其对分析物的保留与基质的分离和在质谱中离子谱应的高低。在选定 Retain AX柱作为 SPE 柱后，当用乙腈作为流动相时，碱性的 ZT 在 Retain AX 柱上的保留性能明显下降，在死时间直接被洗脱下来，无法与基质分离；但选择甲醇作为上样流动相时，这种情况就可以避免，推断 ZT在Retain AX 上的保留主要是依靠反相色谱原理，与其在反相色谱中的保留性能有明显的相关性。本方法同时采集正负离子信号，不宜添加过多的酸碱离子添加剂。在相同条件下，采用甲醇作为分析流动相时，植物激素的响应值明显优于乙腈。综合以上因素，本方法选择甲醇-水作为分析流动相。 图3 分析物标准品(A)和种子样品(B)SRM质量色谱图 Fig.3 Representative SRM chromatograms of the analytes standards (A) and seed samples (B) 3.2 阀切换时间 在线固相萃取样品处理过程包括3个过程：样品组分由进样器与 SPE 泵流动相引入到 SPE 柱，色素、鞣质、植物蛋白等基质干扰物从柱上流出，并排至废液收集器，同时分析物植物激素保留在 SPE 柱上；通过阀切换，将分析物植物激素由 SPE 柱转移至分析柱；阀切换到初始位置，分析物植物激素在分析柱上保留洗脱，同时 SPE 柱则进行离线清洗和平衡，为下一针进样准备。因此，阀切换时间对于在线固相萃取是一个显著影响因素，为确定合适的切换时间，本实验将 SPE 柱直接与紫外、质谱等检测器连接，分别检测进样样品和加标样品，获得准确的基质流出时间以间组分切换时间(5 min)；阀切换在用两通代替分析柱的情况下，用分析泵流动相将植物激素洗脱，进入到检测器，同时考虑保留时间会有微小波动，时间窗太窄，容易造成目标物损失；时间窗太宽，会使残余的干扰物进入分析柱，对分析柱分离产生影响，最终确定组分转移时间为9 min。系统阀切换示意图见图1. 3.3 方法线性范围、检测限和精密度考察 分别移取适量赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)和脱落酸(ABA)的标准工作溶液至 10 mL 棕色量瓶中，制成系列混合标准品溶液，以40%甲醇稀释，进样10uL，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，做线性回归，权重1/X。结果表明，GA3， IAA， ZT 在0.1~50 ug/L的范围内，线性相关系数R²分别为 0.9944，0.9951，0.9920；标准品连续稀释，按照3倍信噪比(S/N)计算，检出限为0.0002 pg/g； ABA 在0.5~50 ug/L 的范围内，R²=0.9964，按照3倍信噪比(S/N)计算，检出限为0.0010 ug/g。取高(40 ug/L)、中(4 ug/L)、低(0.8 ug/L)3个浓度的标准品溶液连续进样5天，每天测定5次，考察精密度。新鲜配制的标准品溶液与在室温放置12h 后，比较峰面积，考察室温稳定性，结果见表3。 表3 准确度、精密度和稳定性结果 Table 3 Summary of accuracy， precision， stability of all analytes (n=5) 精密度 Precision 稳定性 Stability 分析物 浓度水平 日间 日内 误差 相对标准偏差 Analyte Added level Intra-day Inter-day RE RSD (%) (%) (%) (%，n=5) Low 2.7 3.4 -8.7 5.4 Zeatin Middle 3.1 4.7 -8.6 2.2 High 2.1 2.9 -3.0 2.5 Low 4.5 8.0 -4.0 4.3 IAA Middle 3.4 6.2 0.1 3.9 High 2.2 4.5 -2.9 3.2 Low 7.6 3.8 0.48 8.0 ABA Middle 3.4 4.1 -5.4 2.5 High 2.9 4.8 -6.0 6.3 Low 8.1 7.1 -11.6 8.0 GA3 Middle 4.7 5.1 -7.3 5.6 High 2.2 3.3 -3.8 4.8 溶液1mL，按照2.2节处理样品，并测定 GA3、IAA、ZT和 ABA 的含量，计算回收率。结果表明， GA3、IAA、ZT和 ABA 平均回收率为 76.1%~93.5%，RSD 为0.8%~6.0%。实验结果见表4。 表4 样品回收率(n=5) Table 4 Recovery of all analytes in plants tissues (n=5) 提取回收率 基质效应 提取回收率 基质效应 分析物 Extracton recovery Matrix effect 分析物 Extracton recovery Matrix effect RSD (%) Analyte 平均值 Mean (%) RSD (%) 平均值 Mean (%) RSD (%) Analyte 平均值 Mean (%) RSD (%) 平均值 Mean (%) Zeatin 93.5 3.3 92.4 4.8 ABA 81.3 6.1 101.4 2.8 IAA 76.1 6.0 98.4 2.5 GA3 91.9 0.8 102.3 7.1 3.5)样品测定 采用本方法对自行采集的3份成熟期鲜样样品中4种目标化合物进行检测，其中将叶片、籽粒、荚皮分别测定，每个样品重复测定3次。结果见表5。 4结论 本实验建立了双三元液相色谱串联质谱测定大豆不同部位的内源激素在线固相萃取液质联用分析方法。在满足常规分析的同时，针对本实验中遇到的基质干扰大、样品前处理复杂、重现性差、目标分析物含量低等问题 Table 5 Determination of GA3， IAA， ZT and ABA in tissuessamples 样品 ZT IAA ABA GA3 Sample (pg/g) (pgg) (ug/g) (ugg) 叶片 Leaf 0.00104 ND 0.049 0.0357 籽粒 Soybean 0.00167 0.101 3.30 0.0089 皮 Pod skin 0.00204 0.0026 0.062 0.0143 ND： Not detected. 通过 Online SPE 技术在线除杂富集解决，有较多成熟的应用[15，16] 通过与已发表的关于植物激素研究的文献比较 11，12]，本方法的检测限有明显优势，通过选择合适的 SPE 柱，保证不同性质的植物激素可以同时保留，与基质分离，一次进样同时检测酸碱性植物激素， 检测结果更加全面，提高了检测效率。文献[17]采用HPLC 方法分析大豆中的植物激素， GA3 检出限为0.5 pg/g，样品未检出，ABA 含量明显高于其它成分。本实验结果与文献[17]相符。本方法样品前处理简单方便，灵敏度高，固相萃取在线分析技术是一种高通量，快速的植物内源激素检测技术，检出限完全能满足农业科学研究需要。被测组分提取、浓缩、分离的在线进行，不仅省时而且改善了检出限；而且具有抗化学干扰、可靠性好的优点，特别适用于复杂基质中低含量组分的检出。本方法将有望广泛地应用于农业科学领域生理生化指标中被测物的高灵敏度、高准确度检测。 ( References ) ( Ulger S， Sonmez S， Karkacier M， Ertoy N， Aksu M. 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Anautomated on-line SPE and innovative fast polarity switch analysis method employing dual-gradient liquidchromatography (DGLC))coupled with tandem mass spectrometry (DGLC-MS/MS)was established andvalidated for the simultaneous determination of gibberellic acid (GA3)， indole acetic acid (IAA)， zeatin(ZT) and abscisic acid (ABA) in the soybean plant (leaf， grain and pod). The method was applied in theactual sample detection successfully. In order to acquire higher sensitivity， recovery， stability and precision，some conditions including SPE column， analytical column， mobile phase， additive etc were optimizedaccording to the selection and retain of hormone..Bean(sSwere cryogenically grinded by liquid nitrogen，extracted by 80% methanol， certrifugatel and dilluted with water， and then injected directly. Samples weretransported and gradient eluted on the analytical column Acclaim PA2 by 0.1% formic acid in water andmethanol， after retaining and separation on the SPE column Hypersep Retain AX. All analytes were detectedin selection reaction monitoring (SRM) mode in both positive and negative channels. The quantification wasbased on linear regression. The linear ranges of GA3， IAA and ZT were 0.1-50 ug/L with the LOQ of0.0002 ug/g， and the linear of ABA was 0.5-50 ug/L with the LOQ of 0.0010 pg/g. The recoveries of fourkinds of plants hormones were 76.1%-93.5%， and RSDs were 0.82%-6.02% at low (0.8 pg/L)，medium (4.0 pg/L) and high (40 ug/L). The results noted that the content of ABA in seeds was apparentlyhigher than others. This method could be used for the rapid and accurate detection of hormone in differentparts of soya beans. Keywords Phytohormone； Soya Beans； Dual-gradient liquid chromatography-tandem mass spectrometry；On-line solid phase extraction ( Received 18 August 2014； accepted 17 September 2014) This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 31171503， 31271652 赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、玉米素(ZT)和脱落酸(ABA)是4 种重要的植物内源激素,广泛分布在植物体内,对植物细胞的生长、分化、分裂、器官建成、植物的休眠萌发形态反应等都有直接或间接的调节控制作用,参与植物生命的所有活动[1 ~3] 。但是,内源激素因其在植物中的含量极低,基质干扰多,使得农作物内源激素的测定十分困难,因此痕量激素的测定技术已成为制约植物激素学界研究的最大瓶颈之一,同时也是分析科学领域的研究热点[4] 。目前,关于农作物中内源激素测定的文献报道多结合液相色谱技术或液相色谱鄄质谱联用技术,进样前几乎均采用固相萃取(SPE)技术去除农作物中复杂基质干扰。显然,固相萃取技术在复杂基体中痕量组分分析中处于核心地位,是农作物内源激素测定较为理想的选择[5,6] 。已发表的文献报道表明,其所采用的固相萃取方法处理过程基本上还处在手工操作阶段,存在过程复杂、耗材消耗量大、有毒试剂接触多、需要额外氮吹、重现性差、无法实现全自动联机和通量低等问题。本实验所采用的在线固相萃取技术是一种全自动的在线样品前处理方式,是近年来商品化的仪器样品前处理新技术。在线联接可避免因复杂前处理过程而带来的分析物损失,减少操作者因溶剂挥发与有毒溶剂的接触,节省时间,提高效率、可靠性和灵敏度,在线固相萃取分析越来越受到人们的重视[7,8] 。目前,在线固相萃取技术在农业科学领域的应用并不多见,因此本方法较已发表的关于测定植物激素的方法[9,10] 具有前处理简便、实验快速、灵敏度高等优点。植物激素包括生长素(Auxins)、赤霉素(Gibberellins)、细胞分裂素(Cytokinins)、脱落酸(Abscisic acids) 和乙烯(Ethylene) 五类,已发表的文献主要是考察其中某些酸性[11] 或者碱性[12] 的植物激素,缺乏全面性,本研究考察的4 种植物激素IAA, ZT, ABA 和GA3,分别属于生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素。本方法有利于全面考察农作物中植物激素含量。