动物源性食品中甲砜霉素检测方案(液质联用仪)

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动物源性食品中氯霉素类药物的LC-MS/MS定量分析方法 ABSCIEX 动物源性食食中氯霉素类药物的LC-MS/MS定量分析方法 一、背景 氯霉素 (Chloramphenicol)是一种广谱抗生素，其对伤寒杆菌、流感杆菌、副流感杆菌和百日咳杆菌的作用良好，对立克次体感染如斑疹伤寒也有效，但对革兰阳性球菌的作用不及青霉素和四环素。氯霉素对人类的毒性较大，它会引起再生障碍性贫血、新生儿灰色综合症等疾病，尤其是氯霉素的低浓度药物残留会诱发致病菌的耐药性。食品中氯霉素的残留不但对人体造成危害，而且该药已在国外较多国家禁用，严重影响我国食品的出口，因此准确测定食品中氯霉素的残留量具有重要意义。 目前《GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》中详细介绍了水产品、畜牧产品和畜牧副产品中氯霉素类化合物残留量的气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法，方法中采用内标法定量检测氯霉素，以及外标法对甲砜霉素和氟甲砜霉素进行定量。本文中将详细介绍采用AB SCIEX 3200 QTRAPLC-MS/MS检测氯霉素，并且经实验证实AB SCIEX API 4000TM系列、API 5000TM以及API5500TM系列同样适用于该方法。 二、化合物信息 表1.化合物基本信息 化合物 英文通用名 分子量 CAS 分子式 氯霉素 Chloramphenicol 323.1 56-75-7 C1H12CI2N205 甲砜霉素 Thiamphenicol 355.0 15318-45-3 CHCINO，S 氟甲砜霉素 Florfenicol 357.0 73231-34-2 CHCLFNO，S 三、前处理方法 (GB/T 22338-2008) 1.样品提取 1.1.动物组织(肝、肾除外)与水产品 称取试样5g(精确至0.01g)，置于50mL离心管中，加入100pL氯霉素代内标(氯霉素-D5)工作溶液和30mL乙腈，匀浆，离心5 min。将上清液转移至250mL分液漏斗中，加入15mL乙腈饱和的正己烷，振荡5 min， 静置分层，转移已经层至100mL棕色心形瓶中。残渣中再加入30mL乙腈，振摇3 min，离心5 min， 取上清液转移至同一分液漏斗，振荡5 min， 静置分层，转移乙腈层至同一棕色心形瓶中。向心形瓶中加入5mL正丙醇，于40℃水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加5mL丙酮-正己烷(1+9)溶解残渣。 1.2.动物肝、肾组织 称取试样5g(精确至0.01g)，置于50mL离心管中，加入30mL乙酸钠溶液，均质2 min， 加入300 uLβ-葡萄糖醛酸苷酶，，于37℃温育过夜。消解样品中加入100uL氯霉素气代内标(氯霉素-D5)工作溶液和20mL乙酸乙酯-乙醚(75+25)，振荡2 min， 离心5 min。取上层有机层入心形瓶中，在40℃水浴中旋转蒸发近干，用氮氮吹干，加5mL丙酮-正己烷(1+9)溶解残渣。 1.3.蜂蜜 称取蜂蜜试样5g(精确至0.01g)， 置于50mL离心管中，加入100pL氯霉素代内标(氯霉素-D5)工作溶液，5mL水混匀。再加入20mL乙酸乙酯，振摇2 min， 离心5min， 移取有机层到100mL棕色心形瓶中。于离心管中在加入20mL乙酸乙酯，振摇2 min， 离心5 min， 合并有机层至同一棕色心形瓶中，于40℃水浴中旋转蒸发至干，加3mL水溶解残渣，混混。 2.净化 2.1.动物组织与水产品 用5 mL丙酮-正己烷淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将残渣溶解溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5mL丙酮-正己烷(6+4)洗脱，收集洗脱液于心形瓶中，40℃水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加1mL水定容，定容液过0.45 um滤膜至进样瓶，待测定。 2.2.蜂蜜 分别用5mL甲醇，5mL水活化EN固相萃取住，将提取液转移上柱，用5mL水淋洗，用玻璃棒压干1min，用3mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液用氮气吹干，用1mL水定容，定容液过0.45pm滤膜至进样瓶，待测定。 四、实验方法 1.液相条件 色谱柱： Phenomenex Aqua 2.0X50mm， 5um； 柱温：45℃； 流速：400uL/min； 流动相：A，水；B，乙腈； 梯度洗脱，洗脱条件见表2： 表2.液相色谱条件 时间(min) A(%) B(%) 0 75 15 0.5 75 15 4 50 50 5 50 50 5.2 75 15 8 75 15 2.质谱条件 离子源： Turbo VTM离子源； 扫描模式：负离子 采集模式：多反应监测MRM 表3.氯霉素类化合物MRM离子对 化合物名称 母离子 子离子1 子离子2 氯霉素 321 152 257 甲砜霉素 354 185 290 氟甲砜霉素 356 336 185 氯霉素-D5(内标) 326 157 五、定量质谱数据 色谱图示例 2.定性线性曲线 2.1.氯霉素(0.005~1ng/mL) y=1.03850e6x+ 895.10620 (r=0.99809) (weighting： 1/x^2) 0.3 04 0.5 45 0T 08 09 Levels 已知浓度(ng/mL) 实测浓度 (ng/mL) 准确度(%) 1 0.005 0.005 102.6 2 0.010 0.010 98.7 3 0.020 0.018 91.8 4 0.050 0.050 100.2 5 0.100 0.102 101.9 6 0.200 0.195 97.3 7 0.500 0.487 97.3 8 1.000 1.101 110.2 2.2.氟甲砜霉素 (0.005~1ng/mL) y=1.10818e6x+921.19434(r=0.99873) (Weighting： 1/x^2) Levels 已知浓度(ng/mL) 实测浓度(ng/mL) 准确度(%) 1 0.005 0.005 104.6 2 0.010 0.009 91.1 3 0.020 0.020 97.8 4 0.050 0.052 103.9 5 0.100 0.101 100.8 6 0.200 0.196 98.2 7 0.500 0.511 102.2 8 1.000 1.015 101.5 2.3.甲砜霉素(0.01~1ng/mL) y=3.59685e5x+683.73073 (r=0.99913) (weighting： 1/x^2) 4 Levels 已知浓度(ng/mL) 实测浓度 (ng/mL) 准确度(%) 1 0.010 0.010 97.8 2 0.020 0.021 102.8 3 0.050 0.051 102.8 4 0.100 0.105 105.3 5 0.200 0.193 96.5 6 0.500 0.487 97.5 7 1.000 0.974 97.4 0.010 0.010 97.8 六、重现性数据 鱼肉基质样品连续6针进样峰面积的重现性。 氯霉素 氟甲砜霉素 甲砜霉素 浓度平均值(ng/mL) 0.006 0.86 0.94 平均峰面积(RSD%) 6.765e3(4.6%) 9.538e5(1.8%) 3.406e5(1.3%) 七、结论 7.1 采用AB SCIEX系列串联三重四极杆质谱，灵敏度完全可满足食品中氯霉素类抗生素测定最严格的法规要求。 7.2可精确定量分析，特别是在分析复杂基质样品中氯霉素残留时，实验结果可看到低浓度同样具有良好的重现性以及准确性。 食品中氯霉素的残留不但对人体造成危害，而且该药已在国外较多国家禁用，严重影响我国食品的出口，因此准确测定食品中氯霉素的残留量具有重要意义。目前《GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》中详细介绍了水产品、畜牧产品和畜牧副产品中氯霉素类化合物残留量的气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法，方法中采用内标法定量检测氯霉素，以及外标法对甲砜霉素和氟甲砜霉素进行定量。本文中将详细介绍采用AB SCIEX 3200 QTRAP® LC-MS/MS检测氯霉素，并且经实验证实AB SCIEX API 4000™系列、API 5000™以及API 5500™系列同样适用于该方法。