动物源性食品中AOZ检测方案(液质联用仪)

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动物源性食品中硝基呋喃及其代谢物LC-MS/MS分析方法 ABSCIEX 动物源性食品中中基呋喃及其代谢物LC-MS/MS分析方法 一、背景 硝基呋喃 (Nitrofurans)抗菌剂是一种广效性抗生素，目前国家在水产养殖业已禁止使用，但因其低廉高效，经营者对其毒性和危害认识不够，以及相关法律法规和监控水平的不健全，使得这类药物仍然屡禁不止。硝基呋喃类药物残留问题严重威胁着人民的身体健康，也已对我国的水产品出口贸易造成不良影响，因此加强水产品中硝基呋喃类药物的监控是一项刻不容缓的工作。 硝基呋喃检测包括对其代谢物3-氨基-2-恶唑酮(AOZ)、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮(AMOZ)、1-氨基-乙内酰脲(AHD) 和氨基脲(SEM)残留量的检测。我国已有国家标准《GB/T 21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱串联质谱法》，标准中适用于肌肉、内脏、鱼、虾、蛋、奶、蜂蜜和肠衣中硝基呋喃类药物代谢物3-氨基-2-恶唑酮、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮、、1-氨基-乙内酰脲和氨基脲残留量的定性确证和定量测定。本文中将详细介绍采用AB SCIEX API 4000TM LC-MS/MS检测硝基呋喃类药物代谢物，并且经实验证实AB SCIEX API4000+M、4000 QTRAP、API 5000TM以及5500 QTRAP同样适用于该方法。 二、化合物信息 表1.化合物基本信息 简称 英文通用名 分子量 CAS 分子式 AMOZ3-Amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone 201.2 43056-63-9 CgH15N，O： SEM semicarbazide 75.1 57-56-7 CH，N，O AHD 1-amino-hydantoin 115.1 2827-56-7 CH，NO， AOZ 3-Amino-2-oxazolidinone 102.1 80-65-9 CHN，O， 三、前处理方法(GB/T 21311-2007) 3.1提取 3.1.1肌肉、内脏、鱼和虾 从原始样品中取出有代表性样品约500g，用组织捣碎机充分捣碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于-18℃冷冻避光保存。 3.1.2肠衣 从原始样品取出有代表性样品约为100g，用剪刀剪成边长<5mm的方块，混匀后均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于-18℃冷冻避光保存。 3.1.3蛋 从原始样品取出有代表性样品约500g，去壳后用组织捣碎机充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于4℃冷藏避光保存。 3.1.4奶和蜂蜜 从原始样品取出有代表性样品约500g，用组织捣碎机充分混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。将试样置于4℃冷藏避光保存。 注：在制样的操作过程中，应防止样品污染或残留物含量发生变化。 3.2样品处理 3.2.1水解和衍生化 1肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣 称取约2g试样(精确至0.01g)于50mL塑料离心管中，加入10mL甲醇-水混合溶液(1+1，体积比)，振荡10min后，以4000r/min离心5min， 弃去液体。残留物中加入10mL0.2 mol/L盐酸，用均质器以10 000r/min均质1 min后，再依次加入混合内标标准溶液100pL，邻硝基苯甲醛溶液100pL，涡动混合30s后，再振荡30min， 置37℃恒温箱中过夜(16h)反应。 Ⅱ蛋、奶和蜂蜜 称取约2g试样(精确至0.01g) 于50mL塑料离心管中，加入10mL-20mL 0.2 mol/L盐酸(以样品完全浸润为准))，，用均质器以10000r/min均质1 min后，再依次加入混合内标标准溶液100uL，邻硝基苯甲醛溶液100uL，涡动混合30s后，再振荡30 min，置37℃恒温箱中过夜(16h)反应。 3.3提取和净化 取出样品，冷却至室温，加入1mL-2mL 0.3mol/L磷酸钾(1mL盐酸溶液加0.1mL磷酸钾溶液)，用2.0mol/L氢氧化钾调pH7.4(±0.2后)，再加入10mL-20mL乙酸乙酯(乙酸乙酯加入体积与盐酸溶液体积一致)，振荡提取10min后， 以10000r/min离心10 min， 收集乙酸乙层层。残留物用10mL-20mL乙酸乙酯再提取一次，合并乙酸乙酯层。收集液在40℃下用N，吹干，残渣用1mL0.1%甲酸水溶液溶解，再用3mL乙腈饱和的正己烷分两次液液分配，去除脂肪。下层水相过0.20 pm微孔滤膜后，取10pL供仪器测定。 3.4混合基质标准溶液的制备 3.4.1肌肉、内脏、鱼、虾和肠衣 称取5份约2g的阴性试样(精确至0.01g)于50mL塑料离心管中，加入10mL甲醇-水混合溶液(1+1，体积比)，振荡10min后， 以4000r/min离心5 min， 弃去液体。残留物中加入10mL0.2mol/L盐酸，用均质器以10000 r/min均质1 min后，按照最终定容浓度：0.5，1.0，2.0，5.0，10.0和25ng/mL，分别加入混合中间标准溶液或混合标准工作溶液，再加入混合内标标准溶液100uL，余下操作同3.2.1和3.3。 3.4.2蛋、奶和蜂蜜 称取5份约2g的阴性试样(精确至0.01g)于50mL塑料离心管中，加入10mL-20mL 0.2 mol/L盐酸(以样品完全浸润为准)，，用均质器以10 000r/min均质1 min后，按照最终定容浓度：0.5，1.0，2.0，5.0，10.0和25ng/mL，分别加入混合中间标准溶液或混合标准工作溶液，在加入混合内标标准溶液100 pL， 余下操作同3.2.2和3.3。 四、实验方法 4.1液相条件 色谱柱： Phenomenex Luna C18 2.0×150mm 3pm； 柱温：30℃； 流动相：A：水(含1mM乙酸铵)，B：甲醇(含1mM乙酸铵)； 梯度洗脱，洗脱条件见表2： 表2.液相色谱条件 时间(min) 流速(uL/min) A(%) B(%) 0 200 50 50 6 200 25 75 8 200 25 75 8.5 200 50 50 15 200 50 50 4.2质谱条牛 离子源： Turbo VTM离子源； 扫描模式：正离子； 采集模式：多反应监测MRM； 表3.硝基喃类药物代谢物MRM离子对 化合物名称 母离子 定量离子对 定性离子对 扫描模式 SEM 209 192 166 正离子 AOZ 236 134 104 正离子 AHD 249 134 104 正离子 AMOZ 335 291 262 正离子 五、定量质谱数据 5.1化合物保留时间 图1.0.5ng/mL硝基呋喃类药物化合物基质加标样品的色谱图 图1中展示了0.5ng/mL基质加标样品硝基呋喃类药物代谢物的出峰状况，图中看到色谱峰峰型尖锐，半峰宽窄，经确认此色谱峰点数均大约13个点，满足定量要求。四种化合物保留时间为见图1. 5.2灵敏度检测数据(基质加标) 通过基质加标来测试方法的灵敏度，图2中为浓度均为0.5ng/mL， AHD离子m/z为249/134，此时信噪比S/N为562；AOZ离子m/z为236/134，此时信噪比S/N为515；SEM离子m/z为209/192，此时信噪比S/N为52； AMOZ离子m/z为335/291，此时信噪比S/N为549； (信噪比S/N按照噪音的3倍标准偏差计算) 在标准《GB/T 21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法高效液相色谱串联质谱法》中规定该方法AOZ、AMOZ、SEM、AHD的测定低限(LOQ) 均为0.5 pg/kg， 本实验可确定API4000TM完全能够满足检测要求。 图2.硝基呋喃类药物代谢物标准规定LOQ (0.5ng/mL)时的色谱图 图3.硝基呋喃类药物代谢物基质加标曲线 采用基质加标的方法绘制标准曲线，添加基质的样品浓度分别为0.5，1.0，2.0，5.0和10.0ng/mL，来验证方法的准确度，实验结果证明基质加标曲线，线性良好。几种物质基质加标曲线及线性相关系数r见图3。 5.3重现性数据 表1.不同进样体积基质加标定量限浓度0.5ng/mL相对标准偏差(n=6) 将基质加标定量限限度0.5ng/mL的样品，重复进样6次。表1以氨基脲尿(SEM)为代表显示不同进样体积条件下的相对标准偏差。实验结果证明，进样量为20pL，得到该浓度下SEM的标准偏差(%CV)为4.05%；当选择进样量为40uL， SEM的峰面积的重复性RSD为1.54%。充分证明，该系统完全能满足国标方法中“在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%”的检测要求。 六、结论 6.1采用AB SCIEX API 4000TM灵敏度完全可满足硝基南喃在食品安全法规要求； 6.2采用AB SCIEX API 4000TM可进行精确定量分析，特别是在分析复杂基质样品中硝基呋喃类药物代谢物时，即使在定量限浓度附近，样品也同样具有良好的重现性和准确性。 我国已有国家标准《GB/T 21311-2007动物源性食品中硝基呋喃类药物代谢物残留量检测方法 高效液相色谱串联质谱法》，标准中适用于肌肉、内脏、鱼、虾、蛋、奶、蜂蜜和肠衣中硝基呋喃类药物代谢物3-氨基-2-恶唑酮、5-吗啉甲基-3-氨基-2-恶唑烷基酮、1-氨基-乙内酰脲和氨基脲残留量的定性确证和定量测定。本文中将详细介绍采用AB SCIEX API 4000 LC-MS/MS检测硝基呋喃类药物代谢物，并且经实验证实AB SCIEX API 4000+、4000 QTRAP、API 5000以及5500 QTRAP同样适用于该方法。采用AB SCIEX API 4000灵敏度可满足硝基呋喃在食品安全法规要求；采用AB SCIEX API 4000可进行精确定量分析，特别是在分析复杂基质样品中硝基呋喃类药物代谢物时，即使在定量限浓度附近，样品也同样具有良好的重现性和准确性。