雷尼替丁原料药及制剂中N-二甲基亚硝胺（NDMA）检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA19-163Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-417 http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋Building B2， No.180 Yizhou Road， ShanghaiHotline：021-34193996 LCMS-8050 检测雷尼替丁中基因毒性杂质NDMA LCMSMS-417 摘要：本文利用岛津LCMS-8050三重四极杆液质联用系统建立了雷尼替丁中基因毒性杂质NDMA的分析方法。该方法参考 FDA的测试条件与前处理方案，采用外标法定量，线性相关系数在0.999以上；定量限在1 ng/mL；不同浓度的重复性考察，其保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.06~0.13%和1.68~2.96%之间；雷尼替丁原料药三个不同浓度加标回收率90.3~100.9%之间，方法准确可靠，可用于实际样品的检测。 关键词： LCMS-8050三重四极杆液质联用系统雷尼替丁 NDMA 遗传毒性杂质 (Genotoxic Impurities， GTI)又称基因毒性杂质，是指化合物本身直接或间接损伤细胞 DNA， 产生基因突变或体内诱变，具有致癌可能。N-二甲基亚亚胺 (NDMA)，又名N-亚硝基二甲胺，是由二甲胺与亚硝酸盐在酸性条件下反应而生成的黄色液体，广泛存在于在环境中，已确定为动物致癌物，多种短期致突变试验出现阳性结果。2018年7月，沙坦类药物中陆续被发现检出亚基类化合物NDMA，引起社会的广泛关注，并给相关企业造成巨大损失。2019年9月13日，FDA发表声明，提醒患者和医护人员在雷尼替丁中发现 NDMA， FDA同时亦指出，此 前用于沙坦类药物中氮亚硝胺检测的 GCMS 方法不适用于雷尼替丁，原因在于雷尼替丁的结构中，硝基和二甲胺结构在高温下从母核解离，结合为N-亚硝基二甲胺， 对 GCMS中常用的顶空进样方式结果产生干扰，由此也引起社会上关于此药物基毒杂质超标万倍的不实报道而引发的使用人群恐慌。 目前FDA已公布雷尼替丁中NDMA测定的LC-HRMS和 LCMSMS分析方法。本文参考以上分析方法，采用岛津三重四极杆液质联用仪 LCMS-8050，建立了雷尼替丁原料药及胶囊制剂中 NDMA的分析方法，供相关检测人员参考。 I实验部分 1.1仪器 岛津LCMS-8050三重四极杆液质谱联用系统。具体配置为 LC-30AD×2输液泵，， DGU-20A5在线脱气机，SIL-30AC 自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， FCV-20AH流路切换阀，CBM-20A系统控制器， SPD-20A紫外检测器，LCMS-8050三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.97 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： ACE-C18-AR (4.6 mm l.D. × 150 mm L.，3 um) 流动相：A相-0.1%甲酸水B相-0.1%甲酸甲醇 流速：0.8mL/min 柱温：40℃ 进样量： 10uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为5%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 泵 B.Conc 5 2 泵 B.Conc 13 4.93 控制器 Event 1* 6 泵 B.Conc 13 6.1 泵 B.Conc 100 10 泵 B.Conc 100 10.1 泵 B.Conc 5 14 控制器 Stop 注：：*“1”表示流路切换至废液； LCMS-8050 质谱条件： 离子源： APCI(+)雾化气流速：3L/minDL温度：180℃接口温度：300℃ 接口电压：3.5 kV加热模块温度：200℃扫描模式：多反应监测(MRM)干燥气流速：5.0 L/min MRM参数：见表2 表2MRM 参数 No. 名称 CAS 前体离子 产物离子 Q1 Pre CE(V) Q3 Pre Bias(V) Bias(V) NDMA 62-75-9 75.15 43.05* -11 -12 -17 58.10 -13 -18 -17 注：*表示定量离子 1.3标准溶液的配置 取 NDMA标准贮备液(100mg/L)，用纯水做溶剂逐级稀释为1、2、5、10、20、50、100、200 ng/mL的标准系列工作溶液，待上机分析。 1.4样品前处理方法 原料药：准确称取120 mg 原料药样品至塑料离心管中，加入4mL纯水溶液，涡旋混匀使样品完全溶解，上清液经过 0.22 um 滤膜过滤后，上机分析。 胶囊制剂：准确称取适量的内容物，加纯水溶解，以达到30 mg/mL 雷尼替丁的目标浓度，涡旋震荡混匀40 min， 上清液经过 0.22 um 滤膜过滤后，上机分析。 |结果与讨论 2.1 NDMA 的标准品 MRM 色谱图与雷尼替丁原料药UV图 按照1.3配制10 ng/mL的NDMA标准溶液上分分析，所得色谱图如图1左图所示，雷尼替丁原料药按照1.4处理上机分析，通过紫外检测器监测雷尼替丁色谱图如图1右图所示，从图中可以看出 NDMA 与雷尼替丁有很好的分离度。 图1 NDMA的标准品(10ng/mL) MRM色谱图(左)与雷尼替丁原料药UV图(右) 2.2线性范围 按照1.3配制成各浓度标准溶液，以各目标物浓度为横坐标，目标物峰面积为纵坐标，以外标法绘制标准曲线，所得校准曲线线性关系良好，线性相关系数大于0.999，准确度在93.2%-110.6%之间。曲线结果如下图2所示。 图2NDMA标准曲线 2.3灵敏度实验 配制1ng/mL标准溶液进行灵敏度测试，其结果如图3所所。 图3空白(左图)与1.0ng/mL标准样品(右图)色谱图 2.4重复性考察 按照1.3步骤配制低、中、高三个浓度标准溶液，连续进样6次，考察保留时间和峰面积的重复性，结果如下表3所示。三个浓度标准溶液的保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD%)分别在0.06~0.13%和1.68~2.96%之间， 满足FDA方法要求(保留时间RSD%<2%，峰面积RSD%<10%)，仪器精密度良好。 表3重复性测试 (n=6) 名称 2.0 ng/mL 10.0 ng/mL 50.0 ng/mL R.T. Area R.T. Area R.T. Area 1 4.454 8951 4.465 40627 4.480 222385 2 4.466 8727 4.472 40530 4.475 216172 3 4.460 9421 4.472 41574 4.476 224656 4 4.470 9013 4.469 41109 4.475 224270 5 4.465 8726 4.471 41677 4.481 222564 6 4.464 8796 4.557 43096 4.480 216806 AVG 4.463 8939 4.470 41435 4.478 221142 RSD/% 0.13 2.96 0.06 2.27 0.06 1.68 2.5加标回收实验 将雷尼替丁原料药样品按1.4步骤进行处理，并添加三个不同浓度的标准溶液，添加浓度分别为原料药中浓度的80%、100%、120%，每个浓度的加标样品平行三份，色谱图见图4，加标回收结果见表4，三个不同浓度加标回收率在90.3~100.9%之间，平行三份样品的相对标准偏差(RSD%)在1.77~4.93%之间，方法准确可靠。 表4.加标实验结果(n=3) 名称 加标浓度 测试浓度 回收率 RSD/% (ng/mL) (ng/mL) 原料药样品 - 7.59 - 一 80%加标 5.6 12.75 92.1 1.77 100%加标 7.0 14.65 100.9 4.93 120%加标 8.4 15.18 90.3 4.85 图4加标回收实验色谱图 2.6实际样品测试 将一份原料药及一份胶囊制剂按1.4步骤进行处理，上机分析，平行测定两次，实际样品色谱图见图5，检测结果见表 5。 图5实际样品检测色谱图 表5原料药与制剂检测结果((n=2) 样品名称 测试浓度(ng/mL) 样品浓度(ppm) 原料药 3.89 0.13 胶囊 5.25 0.17 |结论 本实验建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪 LC-30A 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8050 联用测定雷尼替丁原料药及其制剂中NDMA的方法，用外标法定量，定量限为1ng/mL (0.033 ppm) ， 2 ng/mL重复进样6针，其保留时间和峰面积的RSD%分别为 0.13%和2.27%，满足FDA方法要求；雷尼替丁原料药三个不同浓度加标回收率90.3~100.9%之间，平行三份样的 RSD%在1.77~4.93%之间，方法准确可靠。该方法适用于雷尼替丁原料药及其制剂中基因毒性杂质NDMA的测试，供相关人员参考。 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心 本实验建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用测定雷尼替丁原料药及其制剂中NDMA的方法，用外标法定量，定量限为1 ng/mL（0.033 ppm），2 ng/mL重复进样6针，其保留时间和峰面积的RSD%分别为0.13%和2.27%, 满足FDA方法要求；雷尼替丁原料药三个不同浓度加标回收率90.3~100.9%之间，平行三份样的RSD%在1.77~4.93%之间，方法准确可靠。该方法适用于雷尼替丁原料药及其制剂中基因毒性杂质NDMA的测试，供相关人员参考。