尿液中醋酸炔诺酮的含量检测方案(液质联用仪)

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SSL-CA19-100Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-401 岛津企业管理(中国)有限公司分析中心http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区区州路180号B2栋咨询电话：021-34193996Hotline：021-34193996Building B2， No.180 Yizhou Road，Shanghai ATLAS-USIS 和 LCMS-8045联用检测尿液中9种兴奋剂的含量 LCMSMS-401 摘要：本文利用岛津ATLAS-USIS 和LCMS-8045联用，建立了尿液中9种常见兴奋剂的分析方法。该方法前处理采用ATLAS-USIS， 在10 min 之内即可自动完成样品从萃取、取上清、真空干燥全流程；同时实验结果表明：各组分线性相关系数均在0.995以上，线性良好。对高、中、低水平的标准溶液重复进样6针，保留时间和峰面积均表现出了良好的重复性。加标回收实验中，各物质回收率在42.3%~122.1%之间，峰面积RSD%值分别在0.58~7.09之间，表明ATLAS-USIS 精密度良好。采用样品加标方式考察方法灵敏度，9种兴奋剂的定量限在 0.02-0.54 ug/L之间，满足兴奋剂检定规程小于2ug/L 的要求。该方法操作简捷、灵敏度高、分析速度快，特别适合大批量样品检测。 关键词： ATLAS-USIS LCMS-8045 兴奋剂尿液 为维护竞技体育的公平和纯洁，保护运动员的身心健康，兴奋剂检测已成为所有体育比赛中不可或缺的重要环节。兴奋剂种类繁多，结构差异大，并且随着时间的推移不断有新的兴奋剂涌现。为满足兴奋剂检测的要求，兴奋剂检测实验室需要不断完善检测程序，提高检测方法的简便性、灵敏度和准确性。 所有的合成雄性激素类固醇都有与睾酮相似的化学结构，因而具有与睾酮类雄性激素相似的生理作用，能够加速肌肉增长，增强肌肉力量。因此这类药物是目前使用频率最高、范围最广的一类兴奋剂，最常用的有：甲睾酮、康力龙、苯丙酸诺龙等。 检测兴奋剂的方法主要有两种：尿液检测和血液检测，其中尿液检测为主。兴奋剂检测由于基质复杂，对灵敏度要求较高，故主要检测手段为 LC-MS 和GC-MS。同时岛津推出的全自动样品前处理仪 ATLAS-USIS， 可自动进行液-液萃取，实现兴奋剂检材样品制备自动化，大量减少人力物力消耗，避免有机试剂等对操作人员的身体伤害，提高工作效率。本文利用岛津 ATLAS-USIS 和三重四极杆质谱仪 LCMS-8045 联用，建立一种简便、快速、准确的尿液中9种类固醇兴奋剂的分析方法。供相关人员参考。 图19种常见兴奋剂的结构式 |实验部分 1.1仪器 本实验使用岛津全自动样品前处理仪 ATLAS-USIS 和超高效液相色谱仪 LC-30A 与三重四极杆质谱仪 LCMS-8045联用系统。具体配置为 LC-30AD×2输液泵， SIL-30AC自动进样器， CTO-20AC柱温箱，CBM-20A系统控制器，LCMS-8045 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.93 色谱工作站。 1.2分析条件 液相色谱条件： 色谱柱： Shim-pack GISS C18 (2.1mml.D. × 50 mm L.，1.9 um) 流动相：A相-0.1%甲酸+5mM乙酸铵水B相-乙腈 流速：0.3mL/min 柱温：40℃ 进样量：10uL 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始浓度为30%，时间程序见表1。 表1梯度洗脱时间程序 Time(min) Module Command Value 4.50 Pumps Pump B Conc. 90 5.00 Pumps Pump B Conc. 90 5.10 Pumps Pump B Conc. 30 6.50 Controller Stop LCMS-8045 质谱条件： 离子源： ESI(+) 加热模块温度：400℃ 雾化气流速：3.0 L/min加热气流速：10.0 L/min接口温度：300℃ 扫描模式：多反应监测(MRM) 干燥气流速： 10.0L/min MRM参数：见表2 DL温度：250℃ 表2MRM优化参数 No. 名称 CAS 前体离子 产物离子 Q1 Pre Bias(V) CE(V) Q3 Pre Bias(V) 甲睾酮 58-18-4 303.20 109.05* -15 -27 -18 97.10 -12 -27 -17 2 康力龙 10418-03-8 329.10 81.10* -21 -49 -13 95.15 -21 -42 -18 3 美雄酮 72-63-9 301.20 121.15* -21 -24 -20 149.20 -20 -14 -14 4 醋酸炔诺酮 51-98-9 341.20 281.25* -23 -14 -18 109.05 -17 -18 5 氯司替勃 1093-58-9 323.20 143.15* -11 -22 131.05 -11 -29 -25 6 氧甲氢龙 53-39-4 307.30 289.15* -15 -12 -18 271.15 -15 -15 -16 7 苯丙酸诺龙 62-90-8 407.20 105.05* -21 -40 -29 133.05 -21 -20 -11 8 勃地酮 846-48-0 287.20 121.20* -20 -21 -21 135.20 -19 -14 -12 9 群勃龙 10161-33-8 271.10 253.20* -18 -19 -16 199.20 -18 -23 -20 注：*表示定量离子 1.3标准溶液的配置 取浓度为 1.0 mg/L对照品混合溶液，以 ATLAS-USIS 处理的尿液空白基质作为稀释溶剂，依次配制成1、2、5、8、10、20、50 ug/L 的系列浓度。 1.4样品前处理方法 在 ATLAS-USIS 样品管中，先后加入2.5 mL的尿液、1mL磷酸缓冲液(1M， pH 7)、25 uL酶活为 3000u的葡萄糖酶制剂，在55℃温浴1h酶解，酶解结束后将样品冷却到室温，上ATLAS-USIS 进行液液萃取。萃取流程：向样品中加入4mL乙酸乙酯，震荡离心后进行乳化检测，之后取3.0 mL 上清液进行干燥处理。干燥完成后加入1mL 的50%甲醇水溶液复溶， 0.22 um 滤膜过滤上机分析。 |结果与讨论 图29种兴奋剂 MRM色谱图(10 ug/L) 2.2线性范围 按照1.3配制成各浓度混合标准溶液，以各目标物浓度为横坐标，目标物峰面积为纵坐标，以外标法绘制标准曲线((见图3)，所得校准曲线线性关系良好，均大于0.995。线性方程及相关系数见表3. 图39种兴奋剂的标准曲线 表3.校准曲线(权重1/C) 序号 名称 校准曲线 线性范围 相关系数r 准确度% (ug/L) 甲睾酮 Y=(33168.0)X+(3379.47) 1-50 0.999 90.9-109.4 2 康力龙 Y=(18387.4)X+(8329.88) 1-50 0.998 88.3-108.1 3 美雄酮 Y=(240614)X+(46803.3) 1-50 0.997 86.9-111.1 4 醋酸炔诺酮 Y=(9250.09)X+(3797.76) 1-50 0.998 89.1-111.4 5 氯司替勃 Y=(4511.57)X+(1951.80) 1-50 0.997 89.2-112.6 6 氧甲氢龙 Y=(53576.2)X+(53017.8) 1-50 0.996 86.1-114.5 7 苯丙酸诺龙 Y=(39420.3)X+(-12163.5) 1-50 0.997 89.2-118.3 8 勃地酮 Y=(186459)X+(12618.8) 1-50 0.998 89.5-109.0 9 群勃龙 Y=(180196)X+(750.767) 1-50 0.998 86.5-109.2 2.3重复性 按照1.3步骤配制低、中、高三个浓度标准溶液，连续进样6次，考察分析方法保留时间和峰面积的重复性。结果表明：9种兴奋剂的保留时间的 RSD 均小于0.5%和峰面积的RSD 均小于10%，数据表明方法重复性良好。 表4保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 样品名称 RSD% (2 ug/L) RSD% (8ug/L) RSD% (20 ug/L) R.T. Area R.T. Area R.T. Area 甲睾酮 0.19 8.68 0.08 2.14 0.20 1.31 康力龙 0.17 7.21 0.10 1.98 0.18 2.32 美雄酮 0.24 2.12 0.08 0.42 0.24 0.98 醋酸炔诺酮 0.12 5.37 0.09 2.20 0.12 1.33 氯司替勃 0.18 6.66 0.13 6.74 0.16 3.28 氧甲氢龙 0.22 4.97 0.08 3.13 0.24 4.22 苯丙酸诺龙 0.08 2.50 0.08 1.88 0.08 1.07 勃地酮 0.28 1.98 0.08 1.02 0.29 0.72 群勃龙 0.31 2.60 0.08 0.71 0.32 0.58 2.4基质加标实验 取尿样，按照1.4步骤中制备样品和加标样品，两个水平加标浓度如下表5所示，各样品平行测定4次。测试结果显示：9种兴奋剂的加标回收率在42.3%~122.1%之间，相对标准偏差在0.58%~7.09%之间。 表5基质加标实验结果 序号 样品浓度 (ug/L) 加标l(n=4) 加标2(n=4) 名称 加标浓度 回收率% RSD% 加标浓度 回收率% RSD% (ug/L) (ug/L) 1 甲睾酮 ND 2 51.3 7.09 10 44.9 4.59 2 康力龙 ND 2 104.3 3.90 10 82.5 1.33 3 美雄酮 ND 2 65.0 6.64 10 67.9 1.11 4 醋酸炔诺酮 ND 2 102.4 1.91 10 122.1 2.19 5 氯司替勃 ND 2 107.6 5.69 10 106.6 1.35 6 氧甲氢龙 ND 2 106.5 2.90 10 92.1 0.58 7 苯丙酸诺龙 ND 2 42.3 1.59 10 51.4 1.67 8 勃地酮 ND 2 64.7 1.07 10 62.3 0.72 9 群勃龙 ND 2 61.3 3.25 10 61.8 1.13 注：ND表示未检出 2.5灵敏度实验 在尿液中加入浓度为2 ug/L (康力龙、醋酸炔诺酮、苯丙酸诺龙、氯司替勃)和0.2 ug/L(甲睾酮、美雄酮、氧甲氢龙、勃地酮、群勃龙)兴奋剂标样，按照1.4进行样品前处理，考察方法的灵敏度，将处理好的样品按1.2中的分析条件下进行测定。通过软件计算信噪比，检出限和定量限，9种兴奋剂的信噪比和方法检出限如下表6所示。在上述回收率的条件下，所有检测目标物的定量限在 0.02-0.54 ug/L之间，满足兴奋剂检定规程小于2 ug/L的要求。 表6信噪比(S/N)和方法检出限以及定量限 名称 浓度水平(ug/L) S/N 检出限(ug/L) 定量限(ug/L) 甲睾酮 0.2 76 0.01 0.03 康力龙 2 58 0.03 0.11 美雄酮 0.2 110 0.01 0.02 醋酸炔诺酮 2 118 0.05 0.17 氯司替勃 2 37 0.16 0.54 氧甲氢龙 0.2 46 0.01 0.04 苯丙酸诺龙 2 494 0.01 0.04 勃地酮 0.2 97 0.01 0.02 群勃龙 0.2 70 0.01 0.03 ■结论 本文利用岛津ATLAS-USIS 和 LCMS-8045联用，建立一种简便、快速、准确的尿液中9种兴奋剂分析方法。该方法采用外标法定量，在1-50 ug/L的范围内，各组分线性相关系数均在0.995以上，线性良好。对高、中、低水平的标准溶液重复进样6针，保留时间和峰面积均表现出了良好的重复性。加标回收实验中，各物质回收率在42.3%~122.1%之间，虽然个别化合物回收率较低，但平行4份样品的峰面积RSD%值分别在0.58~7.09之间， ATLAS-USIS 精密度良好。该方法操作简捷、灵敏度高、分析速度快，特别适合大批量样品检测，可以为尿液中兴奋剂的检测提供很好的借鉴和参考。 Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本文利用岛津ATLAS-USIS和LCMS-8045联用，建立了尿液中9种常见兴奋剂的分析方法。该方法前处理采用ATLAS-USIS，在10  min之内即可自动完成样品从萃取、取上清、真空干燥全流程；同时实验结果表明：各组分线性相关系数均在0.995以上，线性良好。对高、中、低水平的标准溶液重复进样6针，保留时间和峰面积均表现出了良好的重复性。加标回收实验中，各物质回收率在42.3% ~ 122.1%之间，峰面积RSD%值分别在0.58~7.09之间，表明ATLAS-USIS精密度良好。采用样品加标方式考察方法灵敏度，9种兴奋剂的定量限在0.02-0.54 μg/L之间，满足兴奋剂检定规程小于2 μg/L的要求。该方法操作简捷、灵敏度高、分析速度快，特别适合大批量样品检测。