尿样中氯胺酮和脱氢去甲氯胺酮检测方案(液质联用仪)

智能文字提取功能测试中

SSL-CA19-112Excellence in Science Excellence in ScienceLCMSMS-405 http：//www.shimadzu.com.cn上海市徐汇区宜州路180号B2栋Building B2，No.180 Yizhou Road， ShanghaiHotline： 021-34193996 CLAM-2000和 LC-MS/MS联用测定尿样中的氯胺酮及其代谢物脱氢去甲氯胺酮含量 LCMSMS-405 摘要：本文使用岛津全自动生物样本在线前处理设备 CLAM-2000 和LC-MS/MS 在线联用系统，建立了人尿样中氯胺酮及其代谢物脱氢去甲氯胺酮的定量分析方法，整个实验流程不涉及手动前处理操作，从吸取样品、沉淀剂，到样品混匀、过滤，以及将处理完的样品输送到LC-MS/MS 自动进样器均靠仪器自动完成，减少了人为误差，提高分析的准确度，适合尿样中苯丙胺类毒品的快速定量检测。本实验中基基标曲不同浓度点准确度在88.7~112.6%之间，不同浓度加标样品重复进样6次，保留时间RSD 均小于0.1%，峰面积 RSD 均小于4.5%，质控样本实测浓度在允许波动范围内。 关键词： CLAM-2000 LC-MS/MS尿样氯胺酮及其代谢产物 近年来毒品的滥用呈明显增长的趋势，其中氯胺酮(俗称“K粉”)属于最常见的毒品种类之一。它是苯环己哌啶的衍生物，属于分离性麻醉剂，吸食氯胺酮可能引发对吸食者肺部，心脏和大脑的永久损害，甚至导致死亡。氯胺酮的代谢产物包括去甲氯胺酮和脱氢去甲氯胺酮，大部分由肾脏排出。按照国际毒品检验标准，只要在生物检材中检出去甲氯胺酮或脱氢去甲氯胺酮即可作为吸食氯胺酮的证据。 蛋白质沉淀法是尿样等生物样品前处理时常用的一种手段，其几乎适用于任何极性的小分子化合物且 回收率较高。但是离线蛋白质沉淀法操作费时费力，操作人员频繁接触甲醇、乙腈、高氯酸等沉淀试剂和生物样品，具有潜在的生物危害风险。 岛津公司开发的 CLAM-2000 与 LC-MS/MS 联用系统，可利用 CLAM-2000 对全血、血浆、血清、尿液、唾液等生物样品自动进行蛋白质沉淀操作，然后将上清液自动传输至 LC-MS/MS 进行定量检测。 本文利用该系统建立了尿样中氯胺酮及其代谢物脱氢去甲氯胺酮含量的检测方法，以供相关检测人员参考。 I实验部分 1.1仪器 岛津CLAM-2000和LC-MS/MS联用系统，具体配置为： CLAM-2000生物样本自动前处理仪，LC-30AD×2输液泵，DGU-20A5R在线脱气机， SIL-30AC 自动进样器， CTO-20AC 柱温箱， CBM-20A系统控制器， LCMS-8050 三重四极杆质谱仪， LabSolutions Ver. 5.91色谱工作站。 图1CLAM-2000 与 LC-MS/MS联用系 1.2分析条件 液相条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18， 2.1 mm 1.D.×100 mm L.2um 流动相：A相-水+0.1%甲酸+5mM甲酸铵，B相-甲醇+0.1%甲酸+5mM甲酸铵流速：0.40 mL/min， 洗脱方式：梯度洗脱，B相初始比例为25%，梯度时间程序见表1 表1梯度时间程序 Time(min) Module Command Value 0.20 Pumps Pump B Conc. 25 0.80 Pumps Pump B Conc. 60 1.00 Pumps Pump B Conc. 95 1.30 Pumps Pump B Conc. 95 1.40 Pumps Pump B Conc. 25 3.00 Controller Stop 质谱条件 离子化模式： ESI(+) 雾化气流量： 3.0L/min 接口电压： 4kV 加热气流量：10.0L/min 接口温度：300℃加热块温度：400℃ DL 温度：250℃ 干燥气流量：10.0L/min MRM 参数：见表2 表2 MRM 参数 ID 化合物名称 监测离子对 Q1 pre (V) CE (V) Q3 Pre (V) 氯胺酮 238.10>125.10* -17.0 -28.0 -20.0 238.10>179.15 -12.0 -17.0 -16.0 2 脱氢去甲氯胺酮 222.10>142.15* -16.0 -26.0 -23.0 222.10>141.15 -12.0 -37.0 -22.0 注：带“*”表示定量离子对 1.3 CLAM-2000 自动前处理 在 CLAM-2000 控制软件界面 KIT.Cond 菜单的子菜单 protocol项下，编辑样品自动前处理程序，具体步骤为：(1)在过滤管中加入20 pL甲醇活化过滤管，准备上样；(2)吸取尿样30pL上样；(3)加入120 uL甲醇沉淀蛋白；(4)2100 rpm 震荡60秒；(5)抽滤120秒；(6)样品转移至自动进样器进样2uL，流程如图2所示。 图2 CLAM-2000 自动前处理流程 l结果与讨论 本实验采用岛津生物样本全自动在线前处理系统 CLAM-2000 进行尿样的前处理，样品处理结束后会自动将样品输送到 LC-MS/MS 的自动进样器单元进行进样分析。本文中样品自动前处理程序包括吸取样品、吸取蛋白沉淀剂、振摇和过滤，总时间约5 min， 在 LC-MS/MS进行分析的同时，自动前处理程序也在同时进行，并且 CLAM-2000会根据前理理流程同时处理2-3个样品，即对样品的处理进行到振摇这一步骤时，系统会自动开始序列中下一个样品的处理。这种交叉处理样本的行为使得每个样品的 LC-MS/MS 分析时间间隔为5 min， 如图3所示。 图3 CLAM-2000 与 LC-MS/MS 联用工作模式 2.1基质标准品色谱图 图4空白尿样加标 0.5 ng/mL 氯胺酮和脱氢去甲氯胺酮色谱图 2.2校准曲线 图5氯胺酮和脱氢去甲氯胺酮校准曲线(0.2~100ng/mL， 左：氯胺酮；右：脱氢去甲氯胺酮) 在空白尿样中添加目标物标准溶液，依次配制成浓度分别为0.2、0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100 ng/mL的加标溶液，按上述1.3处理流程处理样品后分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果如图5及表3所示。 表3校准曲线(权重1/C) 名称 校准曲线 线性范围 (ng/mL) 相关系数r 准确度(%) Q3 Pre (V) 氯胺酮 Y=(45780.9)X+(878.8) 0.2~100 0.9998 88.7~106.8 -20.0 脱氢去甲氯胺酮 Y=(16540.1)X+(505.1) 0.2~100 0.9995 90.0~112.6 -16.0 2.3精密度实验 表4.保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 名称 浓度 (ng/mL) 保留时间 RSD(%) 峰面积RSD(%) 氯胺酮 0.5 0.03 3.56 5 0.04 1.56 50 0.03 2.18 0.5 0.04 4.24 脱氢去甲氯胺酮 5 0.05 3.34 50 0.03 1.27 浓度为0.5、5、50 ng/mL的空白尿样加标样，按照1.3的处理流程，分别连续平行测定6次，考察该系统的精密度，结果如表4所示，表明 CLAM-2000自动前处理液质联用系统对目标物的分析方法精密度良好。 2.4质控样品测试结果 空白样品中分别加入0.5，5和50 ng/mL标准样品作为质控样QCL，QCM和QCH，标示浓度和允许波动范围如表5所示，实际检测浓度在允许波动范围内。 表5质控样品检测结果 化合物 标示浓度 (ng/mL) 允许波动范围 (ng/mL) 实测浓度 (ng/mL) QCL QCM QCH QCL QCM QCH QCL QCM QCH 氯胺酮 0.5 5 50 0.4-0.6 4-6 40-60 0.52 5.10 48.8 脱氢去甲氯胺酮 0.5 5 50 0.4-0.6 4-6 40-60 0.46 4.98 47.4 l结论 本文使用岛津全自动在线前处理设备 CLAM-2000 和 LC-MS/MS 在线联用系统，建立了人尿样中氯胺酮及其代谢物脱氢去甲氯胺酮的定量分析方法，整个实验流程不涉及手动前处理操作，从吸取样品、沉淀剂，到样品混匀、过滤，以及将处理完的样品输送到 LC-MS/MS自动进样器均靠仪器自动完成，减少了人为误差，提高分析的准确度，适合尿样中苯丙胺类毒品的快速定量检测。本实验中基质标曲不同浓度点准确度在88.7~112.6%之间，不同浓度加标样品重复进样6次，保留时间 RSD 均小于0.1%， 峰面积 RSD均小于4.5%，质控样本实测浓度在允许波动范围内。实验结果表明：该方法适合尿样中氯胺酮及其代谢物脱氢去甲氯胺酮的快速定量检测。 Shimadzu(China)CO.，LTD. Analytical Applications Center 本文使用岛津全自动生物样本在线前处理设备CLAM-2000和LC-MS/MS在线联用系统，建立了人尿样中氯胺酮及其代谢物脱氢去甲氯胺酮的定量分析方法，整个实验流程不涉及手动前处理操作，从吸取样品、沉淀剂，到样品混匀、过滤，以及将处理完的样品输送到LC-MS/MS自动进样器均靠仪器自动完成，减少了人为误差，提高分析的准确度，适合尿样中苯丙胺类毒品的快速定量检测。本实验中基质标曲不同浓度点准确度在88.7～112.6%之间，不同浓度加标样品重复进样6次，保留时间RSD均小于0.1%，峰面积RSD均小于4.5%，质控样本实测浓度在允许波动范围内。