水产品中AHD检测方案(浓缩仪)

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自动化样品前处理解决方案-RK-2019-F002 水产品中硝基呋喃代谢物的测定解决方案 1.介绍 硝基呋喃类药物在人类疾病治疗上也有一定的应用。呋喃妥因(呋喃坦啶)为抑菌剂，多数大肠杆菌、肠球菌对其敏感。呋喃唑酮(痢特灵)口服吸收少，肠内浓度高。主要用于细菌性痢疾和旅游者腹泻。呋喃它酮内服后在肠道不易吸收，故主要用于肠道感染，也可用于球虫病、火鸡黑头病的治疗。呋喃西林临床仅用作消毒防腐药，用于皮肤及粘膜的感染，如化脓性中耳炎、化脓性皮炎、急慢性鼻炎、烧伤、溃疡等。对组织几无刺激，脓、血对其消毒作用无明显影响。 硝基呋喃类因为价格较低且效果好，而广泛应用于畜禽及水产养殖业，以治疗由大肠杆菌或沙门氏菌引起的肠炎、疥疮、赤鳍病、溃疡病等。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用，个别国家已经禁止硝基呋喃类药物在畜禽及水产动物食品中使用，并严格执行对水产品中硝基呋喃的残留检测。本文参考国标20752-2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》进行了鱼肉样品中硝基呋喃代谢物的检测。 图1.四种硝基呋喃类代谢物结构图 关键字：全自动固相萃取；均质器；浓缩仪；高效液相色谱-串联质谱；硝基呋喃代谢物 2.仪器和耗材 Raykol Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站； Raykol Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪； Raykol AH-30 全自动均质器； Raykol MPE 高通量真空平行浓缩仪； Raykol AutoEVA-60全自动平行浓缩仪； HLB固相萃取柱 (Oasis， 60mg/3 mL)； Agilent 1260 高效液相色谱 (HPLC)， Agilent6410质谱检测器号 I(MS)； 甲醇(优级纯)，水； 衍生剂：含2-硝基苯甲醛 0.05 mol/L， 称取0.075g2-硝基苯甲醛溶于10 mL二甲亚砜，现配现用； 盐酸溶液：0.2 mol/L，量取 17 mL浓盐酸用水定容至1000 mL； 氢氧化钠溶液：1mol/L，称取40g氢氧化钠用水溶解，定容至1000mL。 3.样品制备 3.1标准工作曲线配制 称取5个阴性样品2g(精确到0.01g)，分别置于50 mL棕色离心管中，加入10 mL甲醇一水混合溶液(2+1)，均质1min， 再用5mL甲醇一水混合溶液洗涤均质器刀头，二者合并4000 r/min离心5min，吸取上清液弃掉(该步骤对样品进行清洗，防止目标物对阴性样品干扰)。向5个离心管中分别加入适量四种硝基呋喃代谢物混合标准溶液，使四种硝基呋喃代谢物最终测定浓度分别为0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、4.0 ng/mL、 10.0 ng/mL。再向每个离心管中加入适量混合内标标准溶液，使四种硝基呋喃代谢物内标物最终测定浓度均为2.0 ng/mL。 3.2样品提取 向每个样品离心管中加入10 mL 0.2 mol/L 盐酸溶液均质1 min， 用 10 mL 0.2 mol/L 盐酸溶液洗涤均质器刀头，二者合并后加入0.3mL 衍生剂，用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应16 h。(由于硝基呋喃代谢物与蛋白质中的氨基酸结合紧密，故需要加入盐酸进行蛋白变性，长时间的恒温水浴利于目标物的析出与衍生化，注意避光保存，硝基呋喃代谢物中的化合物见光易分解。) 3.3固相萃取净化条件 全自动固相萃取仪 固相萃取柱 活化 淋洗 洗脱 3.4净化 上述衍生溶液放置至室温后，加入5mL 0.1mol/L 磷酸氢二钾溶液，用1 mol/L 氢氧化钠溶液调节溶液 pH约为7.4，4 000 r/min 离心10 min，上清液(若待测样品含脂肪较多，上清液加5mL正已烧，振荡2 min， 4 000 r/min离心10 min 吸取并弃掉正已烷)。 采用 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪进行固相萃取柱的净化，样液以 1 mL/min 的流速通过 Oasis HLB 柱(根据样品量更改上样体积)，待样液全部通过固相萃取柱后用8mL 水洗涤固相萃取柱，弃去全部流出液。用氮气吹干 Oasis HLB固相萃取柱5 min (若不进行吹干，下一步的洗脱无法有效地浸润固相萃取柱，导致洗脱效果变差)。用5mL乙酸乙酯洗脱被测物物15 mL棕色离心管中，使用 AutoEVA-60全自动平行浓缩仪在40℃水浴中吹干，用样品定容溶液(10%乙腈水溶液，含0.3%乙酸)溶解并定容至1.0mL。混匀后过 0.2Hm滤膜用液相色谱一串联质谱测定。 图2. Fotector Plus 硝基呋喃代谢物固相萃取方法 4.检测条件 表1.色谱柱条件 柱子 Waters XBridge BEH HILIC 2.5m×21 mm×150 mm 流速 0.200 mL/min 流动相 A： 0.3%乙酸水溶液，B：0.3%乙酸乙腈溶液 柱温 35℃ 进样体积 10uL 测器 Agilent 6410 离子模式 ESI 吹扫气 11 L/min 氮气温度 350℃ 簇电压 4000 雾化压力 35 psi 梯度洗脱 具体洗脱请见国标 4.2 MRM参数 表2.44种呋喃代谢物的串联质谱检测参数(具体数值请参考标准) Compound Name Precursor Ion Product Ion Dwell Fragmentor Collision Cell Accelerator Energy Voltage 291 40 120 18 7 AMOZ 335 128 40 120 16 7 SEM 209 192 40 115 17 7 166 40 115 12 7 AHD 249 134 40 120 18 7 178 40 120 12 7 134 40 125 14 7 AOZ 236 192 40 125 19 7 4.3 色谱图 下图为4种硝基呋喃代谢物的衍生物(5 ppb) 在液质色谱中的质谱图： 5.方法可行性验证 5.1样品基质加标回收实验 为了验证该方法的回收率，本实验向鱼肉样品 (2g)中加入上述4种种喃代谢物标准品(20uL，100 ug/L)， 进行加标回收验证。测试结果(如表3)所示。四种硝基呋喃代谢物的回收率在94.5-110.5%之间， RSD 值2.1-5.2%之间。 表3.新鲜鱼肉中的加标回收率及 RSD 值 (2 ug/kg) 化合物 加标量 (ng/g) 平均回收量 平均回收率(%) RSD (%) (Compound) AMOZ 2.0 1.94 97.0 3.6 AOZ 2.0 2.21 110.5 5. 2 SEM 2.0 1.89 94.5 2.1 AHD 2.0 2.05 100.3 2.6 6.结果与讨论 6.1硝基呋喃代谢物容易与蛋白多肽链上的羧基键合，因此需要加入浓盐酸进行蛋白组织破坏及酰基水解。另一方面，加入硝基苯甲醛进行衍生化，可增大被测物的分子量，进而避免样品基质中小分子杂质对待测物的干扰。 6.2衍生化反应生成的席夫碱处在过酸或过碱的条件下均容易发生分解，因此在避光衍生化16h后，需要将反应液中和至 pH=7.4左右，然后进行固相萃取净化。 6.3 AMOZ 化合物的极性较强，因此需要控制上样速度在1mL/min左右，否则 AMOZ 衍生物容易穿透固相萃取柱，导致其在液质上的响应值下降。若上样速度大于 2 mL/min， AMOZ 的质谱信号将过低，导致其在仪器上无法被检出。 6.4样品(空白，待测样，工作曲线等)衍生化过程中，需要加入合适的内标进行跟踪反应，避免反应过程中个别样品的衍生化失败，导致测试结果的假阴性。 7.解决方案的优势 睿科AH-30全自动均质器实现多任务的高通量均质，完全取代了手动均质的过程。一次最多处理32个样品，大大提高工作效率。 睿科 Auto Prep 200 全自动液体样品处理工作站能够实现混标制备、标准曲线制备、样品添加和分液等液体样品处理功能，全程无需人员值守，极大减轻工作量并且保护实验人员的身体健康；同时仪器程序化运行可以有效避免人为误差，保证曲线的精密性和准确性。 Fotector Plus 高通量全自动固相萃取仪采用全自动操作，，可以排除人员操作带来的误差，从活化到上样、洗脱一步到位，六通道同时进行；同时Fotector Plus 能够实现高通量处理，最多一天能够处理180个样品，省时省力，真正为批量检测提供帮助。 MPE 真空平行浓缩仪/AutoEVA-60 全自动平行浓缩仪，大大地提高了样品前处理效率，真正完全解放实验室人员劳动。 邮箱： info@raykol.com热线：址： Vwww.raykol.com 网址：vwww.raykol.com热线：箱： info@raykol.com 硝基呋喃类药物在人类疾病治疗上也有一定的应用。呋喃妥因（呋喃坦啶）为抑菌剂，多数大肠杆菌、肠球菌对其敏感。呋喃唑酮（痢特灵）口服吸收少，肠内浓度高。主要用于细菌性痢疾和旅游者腹泻。呋喃它酮内服后在肠道不易吸收，故主要用于肠道感染，也可用于球虫病、火鸡黑头病的治疗。呋喃西林临床仅用作消毒防腐药，用于皮肤及粘膜的感染，如化脓性中耳炎、化脓性皮炎、急慢性鼻炎、烧伤、溃疡等。对组织几无刺激，脓、血对其消毒作用无明显影响。硝基呋喃类因为价格较低且效果好，而广泛应用于畜禽及水产养殖业，以治疗由大肠杆菌或沙门氏菌引起的肠炎、疥疮、赤鳍病、溃疡病等。由于硝基呋喃类药物及其代谢物对人体有致癌、致畸胎副作用，个别国家已经禁止硝基呋喃类药物在畜禽及水产动物食品中使用，并严格执行对水产品中硝基呋喃的残留检测。本文参考国标20752-2006《猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》进行了鱼肉样品中硝基呋喃代谢物的检测。