罗丹明中荧光强度检测方案(分子荧光光谱)

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用于微流控芯片的全波长实时荧光检测系统研制 黄海鹏，陶玲*1，杨宇轩，钱志余，李韪韬 （南京航空航天大学 生物医学工程系,江苏 南京 210016） 摘要：为了连续检测出微流控芯片中不同荧光物质的发射光强度，设计了一套基于LabWindows编程的实时的、发射光波长在340-1200 nm的荧光检测系统。系统将控制光谱仪、采集荧光强度、数据降噪及存储、结果分析及显示等功能结合在一起，实现微流控芯片内荧光强度的实时动态检测及分析。系统采用卤钨灯和光谱仪相结合的方式，通过合理设计激发和探测光纤的位置，结合软件算法控制，来消除激发光和背景荧光的影响；系统无需针对不同的荧光物质选用特定的激发光和滤波片，增加系统的集成度、提高检测的多样性。基于本系统对微流控芯片中两种溶液的荧光强度进行检测，来验证系统的测试性能；同时对微流控芯片中不同浓度的荧光物质进行检测，来验证系统的准确性能。实验结果表明所设计的系统满足微流控芯片内不同荧光物质的荧光强度实时检测的要求，为后续基于微流控芯片的生化免疫分析、药物分析和多细胞生命体等研究提供研究基础和分析手段。关键词：微流控芯片；荧光检测；全波长；LabWindows 中图分类号：O652.9 文献标识码：A DOI：10.11967/2018160606 Development of Full-wavelength Real-time Fluorescence Detection System for Microfluidic Chips Haipeng Huang, Ling Tao*, Yuxuan Yang, Zhiyu Qian, Weitao LI (Department of Biomedical Engineering, Nanjing University of Aeronautics and Astronautics) Abstract: In order to continuously detect the emission intensity of different fluorescent substances in the microfluidic chip, a real-time fluorescence detection system with a wavelength of 340-1200 nm was designed based on LabWindows programming. The system combines the functions of the control spectrometer, fluorescence intensity acquisition, data noise reduction and storage, results analysis and display to realize real-time dynamic detection and analysis of fluorescence intensity in the microfluidic chip. The system uses a combination of tungsten halogen lamp and spectrometer to eliminate the influence of excitation light and background fluorescence by rationally designing excitation and detection of the position of the optical fiber and combining software algorithm control; the system does not need to select specific excitation light for different fluorescent substances and Filters increase system integration and increase detection diversity. Based on this system, the fluorescence intensities of the two solutions in the microfluidic chip were tested to verify the test performance of the system. At the same time, the different concentrations of fluorescent substances in the microfluidic chip were tested to verify the accurate performance of the system. The experimental results show that the designed system satisfies the real-time detection requirements of the fluorescence intensity of different fluorescent substances in the microfluidic chip, and provides the basis and analysis for subsequent biochemical immunoassay, drug analysis and multicellular living body research based on the microfluidic chip. means. Key Words: Microfluidic Chips; Fluorescence detection; Full-wavelength; LabWindows [CLC Number] O652.9 [Document Code] A DOI:10.11967/2018160606 引言控芯片技术是在微米尺度的空间内对流体进行控 微流控芯片技术起源于20世纪90年代[1]，现 制，将生物、化学实验室的基本功能压缩到一个在已发展为世界上最前沿的科技技术之一。微流 几平方厘米的芯片上，并对其结果进行检测与分 基金项目：南京航空航天大学研究生创新基地（实验室）开放基金（kfjj20170324） 通讯作者：陶玲，E-mail: taoling@nuaa.edu.cn 研究报告 研究报告生命科学仪器 2018 第16卷 / 12月刊 研究报告生命科学仪器 2018 第16卷 / 12月刊 析的技术。具有检测速度快、试剂用量少、通量高等显著特点，已应用在生命科学、药物学、生物化学、环境检测等诸多领域[2-5]，得到了科技界的广泛关注。 与传统的分析系统相比，微流控芯片的检测装置要求更高的灵敏度和更快的响应速度。用于微流控芯片的检测装置主要有：紫外吸收检测法、化学发光检测法、电化学检测法以及荧光检测法[6,7]。其中，荧光光谱检测法凭借其良好的选择性、较高的准确度、较宽的线性范围、微量定性定量分析和检测效率高等特点，已逐渐成为该领域检测分析应用最广泛、灵敏度最高的检测技术[8]。 目前，对于微流控芯片检测装置的要求更趋于操作简单、使用方便、便于携带的小型仪器，然而传统的激光诱导荧光检测系统总体上存在体积过大、系统复杂，价格昂贵等局限性，不能满足微流控芯片分析系统的应用需求。针对这一问题，不同研究人员提出了多种解决方案[9,10]。本研究旨在设计一套操作简单、性能可靠的荧光检测系统及其实验平台，用于微流控芯片的全波长实 系统设计与 (时荧光检测。)实现 2.1硬件设计方案 检测系统结构如图1所示。系统由一台卤钨灯、两根光纤、微流控芯片、一台光谱仪以及PC上位机组成。由卤钨灯激发光，激发光再通过光纤沿20 度于微流控芯片的方向照射到微流控芯片的硅胶面上。探测光纤在微流控芯片的玻璃面一侧且垂直于微流控芯片，将荧光物质的发射光传递到光谱仪。光谱仪通过USB数据线与PC上位机连接，同时光谱仪将采集的数据传递到PC上位机。PC上位机将接收到的信号进行显示、分析及存储等操作。 42 图1 检测系统结构图 Fig.1 Hardware architecture 硬件组合安装方式见图2。固体铝制面包板将各部分连接在一起，同时也是微流控芯片的操作平台。卤钨灯能发出360-1000 nm的激发光，可用于绝大多数荧光物质的激发。光谱仪能检测3401200 nm的发出光，可以检测出绝大多数荧光物质的发出光。通过相应的实验验证，将激发光纤和探测光纤成110度的夹角放置时，激发光能透过微流控芯片的硅胶层顺利激发芯片内荧光物质，且此时激发光对荧光检测的影响最小。再通过软件层面的算法操作便可完全消除激发光和微流控芯片的背景光影响。因此这种卤钨灯和光谱仪结合的方式可以满足绝大多数荧光物质的激发和探测要求。不需要为了某种特定的荧光物质按其激发和发射光波长选择特定的光源及滤光片，增加了系统的集成度、简化了操作的复杂度、减少了噪声的影响，也大大减小了实验成本。图2 硬件组合安装方式 Fig.2 Hardware combination installation 2.2软件界面设计 上位机控制软件是整个荧光检测系统的核心，主要包括硬件连接、光谱仪参数设置、数据处理与显示以及数据存储等功能。本研究基于 LabWindows设计了的系统的控制及显示界面[11]。界面主要包括一个“Graph”控件，用来实时显示 2048个光谱点的数据；两个“Strip Chart”控件，分别随时间滚动显示每次采集的光谱数据中最大值和指定波长范围荧光强度的平均值；一个参数设计区域，用来设置采集及数据去噪处理的参数；一个按钮控制区域，用来处理背景数据以及系统的启动和暂停等操作。系统的目标功能在界面上都达到了设计之初的要求，并且实现了易用和美观的界面设计目标。软件界面见图3。 图3 软件界面 Fig.3 Software interface 2.3软件详细设计 光谱仪的驱动与参数设置，利用Ocean Optics 公司提供的OOIDrv32开发包进行二次开发，实现了USB2000光谱仪的驱动及参数设置。设置的参数包括积分时间（曝光时间），积分时间应随采集光的强度相应变化，采集光越强积分时间越低，反之越高，默认值为200 ms；采样间隔，因为微流控芯片中溶液浓度变化速度不会很高，所以采样频率不需要太高，默认值为1 s；平均样本数，若信号噪声较大，可适当增大，默认值为2；平滑宽度，同样当噪声较大时适当加宽，默认值为2。当参数设置完毕便可点击“文件夹”按钮，选择数据存储的文件夹。当代表设备连接的绿灯亮且Graph控件中开始显示实时光谱数据时，说明光谱仪连接成功。否则应当检查光谱仪USB数据线与PC的连接是否有问题，解决问题后点击“设 备重连”便可成功连接。 参数设置完成后，摆放好微流控芯片的位置，确定实验的背景光点击“保存背景”按钮，系统便会保存当前背景数据为TXT文件，并将采集的光强值减去背景值。根据要检测的荧光物质选择感兴趣波长范围，再将指定波长功能打开。 OOIDrv32开发包已将波长340-1200 nm分为2048 个递增的点，系统采用二分法迅速找出最接近的值。在采集的过程中系统计算这段波长范围内光强的平均值。 当一切都设置妥当后，将“监控/记录”开关打到“记录”档，系统便将数据记录到EXCEL中。记录的数据包括：光谱波长值、背景值、每次采集时间、光谱、最大值及波长、最小值及波长、选择波长范围和平均值以便对数据进行二次分析。研究同样对软件整体进行了性能分析与内存优化，在实验的过程中软件运行稳定流畅，系统控制软件主程序流程图见图4。 图4 主程序流程图 Fig.4 Main program flow chart 研究报告 生命科学仪器 2018 第16卷 / 12月刊 实验及结果分析 3.1实验目的 系统搭建完成后，基于本系统分别对微流控芯片中罗丹明B与罗丹明6G两种溶液的荧光强度进行检测，对系统的测试性能进行验证。基于本系统对微流控芯片中不同浓度的罗丹明B荧光强度进行检测，对系统的准确性进行测试。 3.2罗丹明B与罗丹明6G荧光强度对比实验 3.2.1实验方法 选用两种不同的荧光物质：罗丹明B的激发光波长为540 nm、发射光波长为585 nm[12]；罗丹明6G的激发光波长为525 nm、发射光波长为 555nm[13]。分别配置100μg/ml的溶液。 首先，在黑暗环境下，将卤钨灯光源提前打开预热半小时，使光源达到稳定状态。然后，在搭建的实验平台上摆放好微流控芯片、激发和探测光纤的位置后，再分别将罗丹明B与罗丹明6G注入微流控芯片的两个腔室中。最后使用系统分别测量两个腔室中的荧光强度值。实验用微流控芯片如图5所示。实验中系统的参数值均设为默认值。 图5 微流控芯片 Fig.5 Microfluidic Chip 3.3罗丹明6G浓度梯度荧光强度实验 3.3.1实验方法 考虑到后续的实验中，微流控芯片主要应用 44 于荧光标记药物，来检测不同浓度下药物对细胞的作用，从而构建药物动力学模型。将罗丹明的浓度定为药物在体内的正常的浓度范围：0、1、 10、20、40、80 μg/ml[14,15]。 在黑暗环境下，将卤钨灯光源提前打开预热半小时，使光源达到稳定状态。在搭建的实验平台上摆放好微流控芯片、激发和探测光纤的位置后，分别将上述五个浓度的罗丹明6G注入微流控芯片的六个腔室中。在实验中将系统的积分时间设为300 ms，其余参数值均为设为默认值。在测量中，将纯水腔室采集的光强作为背景，移动微流控芯片使用系统测量剩下的五个腔室的荧光强度值。采集过程中每个腔室之间会采集空白区域 10秒左右，以区分不同的腔室。 3.3.2结果及分析 图7为罗丹明6G不同浓度对应的荧光强度，各个浓度下荧光强度基本保持恒定。平均值为 552-558 nm波长荧光强度的平均值。其中1μg/ml 浓度的荧光强度很弱，但依旧可以看出当采集点由腔室转到空白区域时（14 s处），光强数值有所下降。表明本系统在积分时间为300 ms的情况下，最低可以测量1μg/ml浓度试剂的荧光，满足大多数情况下微流控芯片荧光检测的要求。 图7 罗丹明6G不同浓度荧光强度 Fig.7 Rhodamine 6G fluorescence intensity at different concentrations 图8为各个浓度下测得数据的平均值拟合的罗丹明6G标准曲线。罗丹明6G荧光的测定原理：在一定浓度下荧光强度会随着浓度的增大而增大，即具有线性关系[16]。拟合出的标准曲线为 y=2.1364x+7.9574、R2=0.995。罗丹明6G浓度梯度荧光实验表明，本论文研究的系统可灵敏地检测到相应的浓度变化，且测量的准确性较高，已能够满足微流控芯片荧光检测的使用需求。 图8 罗丹明6G荧光标准曲线 Fig.8 Rhodamine 6G Fluorescence Standard Curve 结论 论文基于LabWindows开发平台，结合HL2000-FHSA卤钨灯光源和USB2000光谱仪研制了一套微流控芯片全波长实时荧光检测系统。系统不需要配置相应波长的激发光和滤光片，集成度高、操作简单。控制程序具有良好的稳定及扩展性能，并能存储数据以便进一步研究。通过不同荧光物质的对比和浓度梯度实验，分别验证了系统的检测多样性、精确度、灵敏度、线性度，实验结果表明，系统的可靠性满足微流控芯片内不同荧光物质的荧光强度实时检测的要求，可以为后续基于微流控芯片的生化免疫分析、药物分析和多细胞生命体等研究提供研究基础和分析手段。本系统的性能以及在微流控芯片荧光检测上的有效应用还需要大量实验的进一步验证。 参考文献 Manz A, Graber N, Widmer H M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing[J]. Sensors & Actuators B Chemical, 1990, 1(1): 244-248. Hancock W, Apffel A, Chakel J, et al. Integrated genomic/proteomic analysis[J]. Analytical Chemistry, 1999, 71(21):742A. Takabayashi Y, Uemoto M, Aoki K, et al. Development and optimization of a lab-on-a-chip device for the measurement of trace nitrogen dioxide gas in the atmosphere[J]. Analyst, 2006, 131(4): 573. 孙佳姝, 逯文晶, 蒋兴宇. 基于微流控芯片技术的癌症早期检测[C]// 中国化学会全国生物医药色谱及相关技术学术交流会. 2016. Yuan L I, Xiao W H, Liao J, et al. A simple cellbased microfluidic assay technology for detection of cell apoptosis[J]. Military Medical Sciences, 2016. 何晨光, 杨春江, 王馨. 微流控芯片技术的研究进展[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2010(5): 357-360. 蒋艳. 基于纳米荧光探针的细菌芯片高效分析方法研究1[D]. 重庆大学, 2016. [8] 王世立, 方肇伦. 微流控光谱分析进展[J]. 光谱学与光谱分析, 2000, 20(2): 000143-148. 蔡恩林. 基于微流控芯片的微光电检测系统研究[D]. 浙江大学, 2016. 倪雅楠. 量子点荧光标记在微流控芯片检测生物样本中的应用[D]. 重庆大学, 2013. 王建新, 隋美丽. LabWindows/CVI虚拟仪器设计技术[M]. 化学工业出版社, 2013. [12] 凌绍明, 颜俊. 罗丹明. B分光光度法测定双酚 A含量[J]. 化学世界, 2016, 57(5):284-287. 李志英, 李林, 张焱. 罗丹明6G催化动力学荧光光度法测定水中氟化物[J]. 分析科学学报, 2015, 31(1): 143-145. 白秀峰. 生物药物分析[J]. 2002. 张菁, 胡瑾瑜, 郁继诚,等. 去甲万古霉素临床药代动力学及血药浓度监测[J]. 中国感染与化疗杂志, 2003, 3(4):202-205. 何锡文, 史长虹. 罗丹明. 6G的溶液状态和荧光特性的研究[J]. 分析化学, 1993(9):1008-1012. 传统的激光诱导荧光检测系统总体上存在体积过大、系统复杂，价格昂贵等局限性，不能满足微流控芯片分析系统的应用需求。与传统的分析系统相比，目前对于微流控芯片检测装置的要求更趋于操作简单、使用方便、便于携带的小型仪器。微流控芯片的检测装置要求更高的灵敏度和更快的响应速度。用于微流控芯片的检测装置主要有：紫外吸收检测法、化学发光检测法、电化学检测法以及荧光检测法。本研究旨在设计一套操作简单、性能可靠的荧光检测系统及其实验平台，用于微流控芯片的全波长实时荧光检测。·系统设计与实现图1 检测系统结构图检测系统结构如图1所示。系统由一台卤钨灯、两根光纤、微流控芯片、一台光谱仪以及PC上位机组成。图2 硬件组合安装方式硬件组合安装方式见图2。通过相应的实验验证，将激发光纤和探测光纤成110度的夹角放置时，激发光能透过微流控芯片的硅胶层顺利激发芯片内荧光物质，且此时激发光对荧光检测的影响最小。再通过软件层面的算法操作便可完全消除激发光和微流控芯片的背景光影响。因此这种卤钨灯和光谱仪结合的方式可以满足绝大多数荧光物质的激发和探测要求。·软件界面设计上位机控制软件是整个荧光检测系统的核心，主要包括硬件连接、光谱仪参数设置、数据处理与显示以及数据存储等功能。本研究基于 LabWindows设计了的系统的控制及显示界面。图3 软件界面·软件详细设计光谱仪的驱动与参数设置，利用Ocean Optics 公司提供的OOIDrv32开发包进行二次开发，实现了USB2000光谱仪的驱动及参数设置.研究同样对软件整体进行了性能分析与内存优化，在实验的过程中软件运行稳定流畅，系统控制软件主程序流程图见图4。图4 主程序流程图·实验及结果及分析系统搭建完成后，基于本系统分别对微流控芯片中罗丹明B与罗丹明6G两种溶液的荧光强度进行检测，对系统的测试性能进行验证。基于本系统对微流控芯片中不同浓度的罗丹明B荧光强度进行检测，对系统的准确性进行测试。图5 微流控芯片·结果图6 罗丹明6G不同浓度荧光强度图6为罗丹明6G不同浓度对应的荧光强度，各个浓度下荧光强度基本保持恒定。平均值为 552-558 nm波长荧光强度的平均值。其中1μg/ml 浓度的荧光强度很弱，但依旧可以看出当采集点由腔室转到空白区域时（14s处），光强数值有所下降。表明本系统在积分时间为300 ms的情况下，可以测量1μg/ml浓度试剂的荧光，满足大多数情况下微流控芯片荧光检测的要求。图7 罗丹明6G荧光标准曲线图8为各个浓度下测得数据的平均值拟合的罗丹明6G标准曲线。罗丹明6G荧光的测定原理：在一定浓度下荧光强度会随着浓度的增大而增大，即具有线性关系。拟合出的标准曲线为y=2.1364x+7.9574、R2=0.995。罗丹明6G浓度梯度荧光实验表明，本论文研究的系统可灵敏地检测到相应的浓度变化，且测量的准确性较高，已能够满足微流控芯片荧光检测的使用需求。·结论论文基于LabWindows开发平台，结合HL2000-FHSA卤钨灯光源和USB2000光谱仪研制了一套微流控芯片全波长实时荧光检测系统。系统不需要配置相应波长的激发光和滤光片，集成度高、操作简单。控制程序具有良好的稳定及扩展性能，并能存储数据以便进一步研究。通过不同荧光物质的对比和浓度梯度实验，分别验证了系统的检测多样性、精确度、灵敏度、线性度，实验结果表明，系统的可靠性满足微流控芯片内不同荧光物质的荧光强度实时检测的要求，可以为后续基于微流控芯片的生化免疫分析、药物分析和多细胞生命体等研究提供研究基础和分析手段。本系统的性能以及在微流控芯片荧光检测上的有效应用还需要大量实验的进一步验证。原文摘自黄海鹏, 陶玲, 杨宇轩, et al. 用于微流控芯片的全波长实时荧光检测系统研制[J]. 生命科学仪器, 2018, 16(06):43-47.·参考文献[1]Manz A, Graber N, Widmer H M. Miniaturized total chemical analysis systems: A novel concept for chemical sensing[J]. Sensors & Actuators B Chemical, 1990, 1(1): 244-248.[2]Hancock W, Apffel A, Chakel J, et al. Integrated genomic/proteomic analysis[J]. Analytical Chemistry, 1999, 71(21):742A.[3]Takabayashi Y, Uemoto M, Aoki K, et al. Development and optimization of a lab-on-a-chip device for the measurement of trace nitrogen dioxide gas in the atmosphere[J]. Analyst, 2006, 131(4): 573.[4]孙佳姝, 逯文晶, 蒋兴宇. 基于微流控芯片技术的癌症早期检测[C]// 中国化学会全国生物医药色谱及相关技术学术交流会. 2016.[5]Yuan L I, Xiao W H, Liao J, et al. A simple cellbased microfluidic assay technology for detection of cell apoptosis[J]. Military Medical Sciences, 2016.[6]何晨光, 杨春江, 王馨. 微流控芯片技术的研究进展[J]. 中国国境卫生检疫杂志, 2010(5): 357-360.[7]蒋艳. 基于纳米荧光探针的细菌芯片高效分析方法研究1[D]. 重庆大学, 2016.[8] 王世立, 方肇伦. 微流控光谱分析进展[J]. 光谱学与光谱分析, 2000, 20(2): 000143-148.[9]蔡恩林. 基于微流控芯片的微光电检测系统研究[D]. 浙江大学, 2016.[10]倪雅楠. 量子点荧光标记在微流控芯片检测生物样本中的应用[D]. 重庆大学, 2013.