医疗废水中粪大肠菌群等多种微生物检测方案(微生物检测)

智能文字提取功能测试中

1膜过滤法 疫情期间，医疗污水处理过程中的微生物检测标准及方法解析 在抗击新型冠状病毒疫情过程中，已于确诊病例粪便中检测到病毒核酸阳性，国家卫健委专家提示新冠肺炎有粪口传播的可能性，并在某些特殊的条件下才发生气溶胶传播。针对这一问题，生态环境部发布《关于做好新型冠状病毒感染的肺炎疫情医疗污水和城镇污水监管工作的通知》，要求进一步加强医疗污水和城镇污水监管工作，防止新型冠状病毒通过污水扩散传播。 为什么需要如此重视医疗污水和城镇污水监管工作呢?美国 PM Gundy 的研究团队曾在《Survival of Coronaviruses in Water and Wastewater》一文中指出，水体中的有机物和悬浮固体可以吸附冠状病毒，为病毒的存活提供了保护。同时，从污水流向的我们不难看出，粪便最终排到了污水处理厂，这些可能携带新型冠状病毒的废水，在污水处理中形成携带病毒的气溶胶，从而形成了气溶胶传播的环境，使污水处理人员成为感染风险较大的群体，对阻止疫情传播有很大的影响。因此，医疗机构、污水处理机构及环境监测部门，都是控制病毒通过污水传播的关键。 目前，为有效防止新型冠状病毒通过粪便和污水扩散传播，生态环境部门要求对要接收新型冠状病毒感染的肺炎患者或疑似患者诊疗的定点医疗机构(医院、卫生院等)、相关临时隔离场所及研究机构，严格执行《医疗机构水污染物排放标准》，并参照《医院污水处理技术指南》、《医院污水处理工程技术规范》和《新型冠状病毒污染的医疗污水应急处理技术方案(试行)》等有关要求，对污水和废弃物进行分类收集和处理，确保稳定达标排放；同时，地方生态环境部门要督促城镇污水处理厂切实加强消毒工作，结合实际，采取投加消毒剂或臭氧、紫外线消毒等措施，确保出水粪大肠菌群数指标达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》要求。 通过对比以上标准发现，在这些污水处理过程中，粪大肠菌群数是评判污水处理是否合格的关键微生物指标。研究表明，污水中粪大肠菌群数量与肠道致病菌数量存在相关关系，当污水中粪大肠菌群数超过1174个/L时，即可在污水中检出病原菌，因此将粪大肠菌群数作为特征指示性指标对这些微生物进行控制。 表1各类污水处理及其微生物限量要求 标准名称 应用领域 微生物指标 微生物限量 检测方法 GB 18466-2005《医疗机构水污染物排放标准》 传染病、结核病医 疗机构污 粪大肠菌群数(MPN/L) 100 多管发酵法 综合医疗机构和其他医疗机构污水 粪大肠菌群数(MPN/L) 500(排放标准)5000(预处理标准) 多管发酵法 医疗机构污泥 粪大肠菌群数(MPN/L) ≤100 多管发酵法 《新型冠状病毒污染的医疗污水应急处理技术方案(试行)》 消毒 粪大肠菌群数(个/L) <100 膜过滤法 GB18918-2002《城镇污水处理厂污染物排放标准》 污水 粪大肠菌群数(个/L) 103(一级A标准)104(一级B标准)104(二级标准) 膜过滤法 根据检测方法、应用领域和污染情况的不同，各标准中对粪大肠菌群数的限量也不同(表1)目前，可用于检测水体中粪大肠菌群数的方法有4种，分别是多管发酵法、膜过滤法和快速荧光检测法、酶底物法，其中前三种认可度较高，且使用较广泛。 膜过滤法是目前最常用于水体中粪大肠菌群数检测的一种标准方法，也是《新型冠状病毒污染的医疗污水应急处理技术方案(试行)》中的指导方法，可于地表水、地下水、生活污水、工业废水及医疗污水等样本的检测。 该方法使样品通过孔径为 0.45 u m 的滤膜过滤，细菌被截留在滤膜上，然后将滤膜置于 MFC选择性培养基上，在特定的温度(44.5℃)下培养 24h， 胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，粪大肠菌群能生长并发酵乳糖产酸使指示剂变色，通过颜色判断是否产酸，并通过对呈蓝色或蓝绿色的菌落进行计数，从而测定样品中粪大肠菌群浓度。 膜过滤法的关键在于样品前处理，需借助抽滤装置才可完成，使微生物被截留在无菌滤膜上，并通过物理的方式进行富集，以保证粪大肠菌以菌落形态被检出。目前，市面上已有较为成熟、有效的的水中膜过滤装置，，可用于水体中微生物前处理操作。 DW-28型水中微生物膜过滤装置 专为水质样品前处理、富集等操作设计； 结构精巧，配合精密抽滤泵，保证良好的抽滤效果； 不锈钢材质，可高温高压灭菌，避免交叉污染； 直抽直排，防止废液倒吸。 2多管发酵法 多管发酵法又称最大可能数 (most probable number， MPN) 法或稀释培养计数法，该方法是用于检测地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定中粪大肠菌群数的一种标准方法。 该方法是一种基于泊松分布的间接计数法，利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量(即单位体积存在目标微生物的最大可能数)。 采用多管发酵法时，先将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管(杜氏小管)中，指示产气。然后再44.5℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，最后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。最后通过查MPN表，即可得出粪大肠菌群浓度值。 实验小贴士 该方法在操作过程中，根据样品检出限的不同，可选择12管法(检出限为3MPN/L)或15管法(检出限为5MPN/L) 进行实验，因此需要大量使用试管和液体培养基(每个样品需准备12或15支试管)。若检测样品量较大时，建议可采用培养基分液器来降低工作量。 DW-9型微生物试剂分液器 ● 可用于生理盐水、液体及半固体培养基自动分装； 1L溶液分装到100个 MPN法试管中，最快仅需2分钟； 微电脑系统与精密泵体联合控制，分装精度高； 分装量、分装速度、分装时间、停顿时间、分装次数等参数可自由设定。 采用自动微生物试剂分液器进行实验用品准备，不仅能实现准确的连续分装，还可在保证进度的同时，大大降低工作量。 3快速荧光检测法 快速荧光检测法是一种利用 ATP 荧光原与与微生物特性相结合的快速检测方法，虽然该方法暂未被纳入国家标准中，但由于其操作方便，检测与培养时间短(仅为膜过滤法、多管发酵法的1/3)，目前被很多大型企业作为内部微生物自检的一种重要手段。通过与对应的采样、增菌拭子配合使用，可快速检测水体中粪大肠菌群数量。 快速荧光检测法是在荧光素酶 (lueiferase)和Mg?+的作用下，荧光素 (lueiferin) 与 ATP 发生腺苷酰化反应后被活化，活化的荧光素与荧光素酶相结合，形成了荧光素-AMP复合体焦磷酸(PPi)。该复合物在氧化作用下，产生荧光信号。通过 ATP 检测液检测微生物 ATP 的发光量，达到检测细菌的目的。该方法现已获得 AOAC 研究机构的检测方法性能担保认证。 目前，杭州大微已开发了 DW-ES800 型微生物实时检测系统，该系统基于ATP 荧光快速检测法，采用双模块设计，实现对水体中粪大肠菌群、大肠菌群、大肠杆菌、细菌总数等多种微生物的检测和计数。 DW-ES800 微生物实时检测系统 耗时短：培养时间短(定性8小时，定量1~8小时)，检测时间仅需15秒 范围广：细菌总数、大肠杆菌、总大肠菌群、粪大肠菌群等多种微生物 效率高：双培养通道，可同时培养不同温度微生物 易操作：五步即可完成(增菌拭子采样→培养→转移→检测拭子激活→检测) 可将 RLU 直转换为 CFU 值 4酶底物法 酶底物法是检测水体中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的--种标准方法。该方法是利用在特定温度下培养特定的时间，总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌能产生特定的β -半乳糖苷酶将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解为邻硝基酚(ONP)，呈黄色反应；；且大肠埃希氏菌同时又能产生β-葡萄糖醛酸酶将选择性培养基中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)分解为4-甲基伞形酮，在紫外灯照射下呈荧光反应。统计阳性反应出现数量，查MPN表，再除以接种样品的稀释度。计算相应水样中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的浓度值。由于操作起来较为繁琐，工作量巨大，故在日常检测中很少被使用。 ( 参考文献 ) ( [1] GB 18466-2005 医疗机构水污染物排放标准 ) ( [2] GB18918-2002城镇污水处理厂污染物排放标准 ) ( [3]新型冠状病毒污染的医疗污水应急处理技术方案(试行) ) ( [4]HJ347.1-20 1 8水质粪大肠菌群的测定滤膜法 ) ( [5] HJ 347.2-2018水质粪大肠菌群的 测 定多管发酵法 ) ( [6] HJ 1001-2018水质总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法 ) ( [7] Gundy P M， Gerba C P， Pep p er I L . Survival of Coronaviruses in Water and Wastewater[J].Food and Environmental Virology，2009， 1( 1 )：10-14. ) ( [8] Warden P S， D esarno MS ， V olk S E ， et a l. E va l uation of Colilert-18Q for D etection andEnumeration o f Fecal C o liform Bacteria in Wastewater Using the U.S . Environmental ProtectionAgency Alternative Test P rocedure Protocol[J]. Journal of AOAC International， 2011，94(5)：1-8. )                                                在抗击新型冠状病毒疫情过程中，已于确诊患者粪便中检测到病毒核酸阳性，国家卫健委专家提示新冠肺炎有粪口传播的可能性，并在某些特殊的条件下才发生气溶胶传播。针对这一问题，生态环境部发布《关于做好新型冠状病毒感染的肺炎疫情医疗污水和城镇污水监管工作的通知》，要求进一步加强医疗污水和城镇污水监管工作，防止新型冠状病毒通过污水扩散传播。  为什么需要如此重视医疗污水和城镇污水监管工作呢？美国PM Gundy的研究团队曾在《Survival of Coronaviruses in Water and Wastewater》一文中指出，水体中的有机物和悬浮固体可以吸附冠状病毒，为病毒的存活提供了保护。同时，从污水流向的我们不难看出，粪便最终排到了污水处理厂，这些可能携带新型冠状病毒的废水，在污水处理中形成携带病毒的气溶胶，从而形成了气溶胶传播的环境，使污水处理人员成为感染风险较大的群体，对阻止疫情传播有很大的影响。因此，医疗机构、污水处理机构及环境监测部门，都是控制病毒通过污水传播的关键。 目前，为有效防止新型冠状病毒通过粪便和污水扩散传播，生态环境部门要求对要接收新型冠状病毒感染的肺炎患者或疑似患者诊疗的定点医疗机构（医院、卫生院等）、相关临时隔离场所及研究机构，严格执行《医疗机构水污染物排放标准》，并参照《医院污水处理技术指南》、《医院污水处理工程技术规范》和《新型冠状病毒污染的医疗污水应急处理技术方案（试行）》等有关要求，对污水和废弃物进行分类收集和处理，确保稳定达标排放；同时，地方生态环境部门要督促城镇污水处理厂切实加强消毒工作，结合实际，采取投加消毒剂或臭氧、紫外线消毒等措施，确保出水粪大肠菌群数指标达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》要求。 通过对比以上标准发现，在这些污水处理过程中，粪大肠菌群数是评判污水处理是否合格的关键微生物指标。研究表明，污水中粪大肠菌群数量与肠道致病菌数量存在相关关系，当污水中粪大肠菌群数超过1174个/L时，即可在污水中检出病原菌，因此将粪大肠菌群数作为特征指示性指标对这些微生物进行控制。 表1 各类污水处理及其微生物限量要求 根据检测方法、应用领域和污染情况的不同，各标准中对粪大肠菌群数的限量也不同（表1）。目前，可用于检测水体中粪大肠菌群数的方法有4种，分别是多管发酵法、膜过滤法和快速荧光检测法、酶底物法，其中前三种认可度较高，且使用较广泛。  1 膜过滤法 膜过滤法是目前最常用于水体中粪大肠菌群数检测的一种标准方法，也是《新型冠状病毒污染的医疗污水应急处理技术方案（试行）》中的指导方法，可于地表水、地下水、生活污水、工业废水及医疗污水等样本的检测。   该方法使样品通过孔径为0.45μm的滤膜过滤，细菌被截留在滤膜上，然后将滤膜置于MFC选择性培养基上，在特定的温度(44.5℃)下培养24h，胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，粪大肠菌群能生长并发酵乳糖产酸使指示剂变色，通过颜色判断是否产酸，并通过对呈蓝色或蓝绿色的菌落进行计数，从而测定样品中粪大肠菌群浓度。 膜过滤法的关键在于样品前处理，需借助抽滤装置才可完成，使微生物被截留在无菌滤膜上，并通过物理的方式进行富集，以保证粪大肠菌以菌落形态被检出。目前，市面上已有较为成熟、有效的的水中膜过滤装置，可用于水体中微生物前处理操作。 DW-28型 水中微生物膜过滤装置 l  专为水质样品前处理、富集等操作设计；l  结构精巧，配合精密抽滤泵，保证良好的抽滤效果；l  不锈钢材质，可高温高压灭菌，避免交叉污染；l  直抽直排，防止废液倒吸。 2 多管发酵法 多管发酵法又称MPN法或稀释培养计数法，该方法是用于检测地表水、地下水、生活污水和工业废水中粪大肠菌群的测定中粪大肠菌群数的一种标准方法。  该方法是一种基于泊松分布的间接计数法，利用统计学原理，根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在的数量（即单位体积存在目标微生物的MPN数）。 采用多管发酵法时，先将样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产生的酸使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产生的气体进入倒管（杜氏小管）中，指示产气。然后再44.5℃复发酵培养，培养基中的胆盐三号可抑制革兰氏阳性菌的生长，后产气的细菌确定为是粪大肠菌群。后通过查MPN表，即可得出粪大肠菌群浓度值。 实验小贴士 该方法在操作过程中，根据样品检出限的不同，可选择12管法（检出限为3MPN/L）或15管法（检出限为5MPN/L）进行实验，因此需要大量使用试管和液体培养基（每个样品需准备12或15支试管）。若检测样品量较大时，建议可采用培养基分液器来降低工作量。 DW-9型 微生物试剂分液器 l  可用于生理盐水、液体及半固体培养基自动分装；l  1L溶液分装到100个MPN法试管中，最快仅需2分钟；l  微电脑系统与精密泵体联合控制，分装精度高；l  分装量、分装速度、分装时间、停顿时间、分装次数等参数可自由设定。 采用自动微生物试剂分液器进行实验用品准备，不仅能实现准确的连续分装，还可在保证进度的同时，大大降低工作量。 3快速荧光检测法 快速荧光检测法是一种利用ATP荧光原理与微生物特性相结合的快速检测方法，虽然该方法暂未被纳入国家标准中，但由于其操作方便，检测与培养时间短（仅为膜过滤法、多管发酵法的1/3），目前被很多大型企业作为内部微生物自检的一种重要手段。通过与对应的采样、增菌拭子配合使用，可快速检测水体中粪大肠菌群数量。  快速荧光检测法是在荧光素酶（lueiferase）和Mg2+的作用下，荧光素（lueiferin）与ATP发生腺苷酰化反应后被活化，活化的荧光素与荧光素酶相结合，形成了荧光素-AMP复合体焦磷酸（PPi）。该复合物在氧化作用下，产生荧光信号。通过ATP检测液检测微生物ATP的发光量，达到检测细菌的目的。该方法现已获得AOAC研究机构的检测方法性能担保认证。 目前，杭州大微已开发了DW-ES800型微生物实时检测系统，该系统基于ATP荧光快速检测法，采用双模块设计，实现对水体中粪大肠菌群、大肠菌群、大肠杆菌、细菌总数等多种微生物的检测和计数。 DW-ES800 微生物实时检测系统 l  耗时短：培养时间短（定性8小时，定量1~8小时），检测时间仅需15秒l  范围广：细菌总数、大肠杆菌、总大肠菌群、粪大肠菌群等多种微生物l  效率高：双培养通道，可同时培养不同温度微生物l  易操作：五步即可完成（增菌拭子采样→培养→转移→检测拭子激活→检测）l  可将RLU值转换为CFU值 4 酶底物法 酶底物法是检测水体中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的一种标准方法。该方法是利用在特定温度下培养特定的时间，总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌能产生特定的β-半乳糖苷酶将选择性培养基中的无色底物邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解为邻硝基酚（ONP），呈黄色反应；且大肠埃希氏菌同时又能产生β-葡萄糖醛酸酶将选择性培养基中的4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）分解为4-甲基伞形酮，在紫外灯照射下呈荧光反应。统计阳性反应出现数量，查MPN表，再除以接种样品的稀释度。计算相应水样中总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌的浓度值。由于操作起来较为繁琐，工作量巨大，故在日常检测中很少被使用。 参考文献[1] GB 18466-2005 医疗机构水污染物排放标准[2] GB18918-2002 城镇污水处理厂污染物排放标准[3] 新型冠状病毒污染的医疗污水应急处理技术方案（试行）[4] HJ 347.1-2018 水质 粪大肠菌群的测定 滤膜法[5] HJ 347.2-2018 水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法[6] HJ 1001-2018 水质 总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法[7] Gundy P M , Gerba C P , Pepper I L . Survival of Coronaviruses in Water and Wastewater[J]. Food and Environmental Virology, 2009, 1(1):10-14.[8] Warden P S , Desarno M S , Volk S E , et al. Evaluation of Colilert-18® for Detection and Enumeration of Fecal Coliform Bacteria in Wastewater Using the U.S. Environmental Protection Agency Alternative Test Procedure Protocol[J]. Journal of AOAC International, 2011, 94(5):1-8.