水中磺胺类药物检测方案(液质联用仪)

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AgilentTrusted Answers 超高效液相色谱串联质谱法测定水中的磺胺类药物 Xiulan Zhang， Chaofei Zhu，Jing Guo， Meiling Lu，Cuiling Wu， Wei Du ，Wenlong Yang， Liang Dong'，Yeru Huang'1 国家环境分析测试中心中国北京，100029 ( 2 安捷伦科技(中国)有限公司中国北京，100121 ) 研究发现环境水体中抗生素污染相当广泛，包括磺胺类抗生素。本应用简报介绍了一种将固相萃取 (SPE) 与液相色谱-串联四极杆质谱(LC/MS/MS) 联用来测定水中磺胺类抗生素的可靠方法。所述的 LC/MS/MS 方法在纯水中线性关系良好，在测试的 0.5-100 pg/L 浓度范围内，，19种磺胺类化合物的线性回归系数均高于0.996。这些化合物的方法定量限 (LOQ) 值(S/N=10)均处于2 ng/L或以下的水平。纯水中浓度为20、200和400 ng/L 的加标回收率测试表明，大多数化合物的回收率值在70.5%-96.4%的范围内， RSD (n = 6) 低于15%。以地表水为基质，在20 ng/L 的浓度水平进行加标回收测试，所有分析物的加标回收率均在80.2%-89.5%的范围内，RSD 低于20%。这些结果表明，所开发的方法灵敏、准确、可靠，可以用于实际环境地表水的分析。 据估计，全球每年人类和牲畜使用的抗生素超过100000吨， 且由于大多数抗生素未经有效处理就排入环境，这些物质在环境中的归趋受到日益密切的关注。研究发现，在一些亚洲国家的水体中，某些特定抗生素的含量甚至高达 450 ug/L"。此类污染可能引起抗生素耐药性，破坏微环境的平衡，并进一步影响生态系统。许多调查表明，磺胺类药物是中国水体中存在的主要抗生素类别之之23。但是目前还没有一种稳定可靠的方法用于水体中这组抗生素的常规监测。美国 EPA 1694 方法中针对第1组分析物描述了一种包括10种磺胺类药物及其共生物在内的分析方法4。在中国，磺胺类药物的用量大，涉及的种类多，在环境水基质中的存在经常见诸报道l2.3，常规监测方法仍然倾向于针对单一类别物质。本研究展示了一种使用 SPE 小柱净化富集和 LC/MS/MS 结合的方法同时测定水中18种常见的磺胺类药物和1种共生物的可靠方法。 化学品与试剂 方法中共选择19种化合物进行监测，其中包括18种磺胺类药物和1种磺胺类共生物(甲氧苄啶)。此外，还包括四种同位素标记的内标 (IS1-IS4)，其中三种内标(IS1-IS3) 作为回收内标，在样品 前处理前添加以用于内标法定量；剩余一种内标 (IS4)作为进样内标，在样品前处理的最后一步加入，用于评估绝对回收率。详细的化合物信息如表1所示。采用 LC/MS 级甲醇 (Merck) 和 Milli-Q水制备流动相。其它试剂(如甲酸、氨水和乙酸铵)均为 HPLC级， 购自 Sigma-Aldrich。 仪器条件 液相色谱条件 Agilent 1290 Infinity II UHPLC系统 ·1290 Infinity Ⅱ二元泵，内置脱气机 ·1290 Infinity Ⅱ自动进样器，具有针座反冲功能 ·柱温箱 色谱柱 Agilent InfinityLab Poroshell C18， 2.1×150 mm， 2.7 pm 流动相 A) 0.2%乙酸水溶液B)甲醇 流速 0.30 mL/min 柱温 35°C 进样量 2.0 pL 后运行时间 3 min 梯度 时间(min) %A %B 0 90 108 60 40 12 35 65 13 5 9516 5 95 质谱条件 质谱仪 Agilent 6470 LC/MS/MS 和 Agilent UItivo LC/MS/MS 离子源 安捷伦喷射流(AJS) 电离模式 正离子 毛细管电压 3500V 喷嘴电压 500V 雾化器气体(N)压力 30 psi 干燥气(N)温度 325°C 干燥气流速 6L/min 鞘气(N2)温度 350°C 鞘气流速 11L/min 采集模式 MRM 方法 样品前处理过程 空白水样为购自当地市场的瓶装纯净水，地表水则采集自当地城市河流。样品体积可在200-1000 mL的范围内，在本文所述的方法中，采用500 mL。根据以下流程图进行样品前处理。 结果与讨论 LC/MS/MS 条件的优化 磺胺类药物都含有一个共同结构(如图1A所示)，在酸性条件下容易发生质子化。因此，使用 Agilent 6470 LC/MS/MS 选择正离子模式和酸性流动相来优化 MS/MS采集参数，所得参数列于表1中。甲醇/酸化水能够使两组异构体获得基线分离，但乙腈/酸化水对异构体磺胺甲氧哒嗪和磺胺对甲氧嘧啶的分离度较差。因此，选择甲醇/酸化水作为二元流动相。 Agilent Eclipse Plus 和 Poroshell C18 色谱柱在甲醇/酸化水条件下均能使异构体获得基线分离。本研究选用 Poroshell 色谱柱，主要是由于其内填键合的薄壳层填料，反压相对较低。进一步调整梯度洗脱，，以确保分析物在短时间内从色谱柱上洗脱下来并得到良好分离(图1B)。 另外，在高有机相组成下冲洗至少四分钟，以除去残留在色谱柱上的强保留基质组分。在6470 LC/MS/MS 下优化得到的 MRM 离子对及其它参数也适用于Agilent Ultivo LC/MS/MS 系统。 图1.(A)磺胺类药物的共同结构。(B)磺胺类药物的典型叠加 MRM 色谱图。注： a).各物质浓度均为 0.5 pg/L；b).所用设备为 Agilent 6470 LC/MS/MS 序号 名称 RT(min) 母离子m/z 碎裂电压 定量离子 定性离子 IS标己 (V) m/z CE (V) m/z CE (V) 1 磺胺醋酰 2.88 215.2 65 156 7 108 20 IS1 2 磺胺嘧啶 3.57 251.3 100 156 16 92 32 IS1 3 磺胺噻唑 4.081 256 100 156.1 14 65.2 56 IS1 4 磺胺吡啶 4.444 250.3 110 91.9 32 156 16 IS1 5 磺胺甲嘧啶 4.811 265.3 110 92 32 65.2 58 IS2 6 甲氧苄啶 5.430 291.3 120 230.1 26 261 28 IS2 7 磺胺甲氧哒嗪 5.629 281.3 100 156 16 92.2 32 IS2 8 磺胺甲二唑 5.844 271.3 90 92.1 28 65.1 56 IS2 9 磺胺二甲嘧啶 6.037 279.3 100 65.2 64 92.1 32 IS2 10 磺胺对甲氧嘧啶 6.354 281.3 110 156 16 92.2 34 IS2 11 磺胺氯哒嗪 6.796 285 100 156 14 92 36 IS2 12 磺胺甲恶唑 7.017 254.3 100 65.2 54 156 16 IS2 13 磺胺间甲氧嘧啶 7.273 281.3 70 156 18 92.2 34 IS2 14 磺胺多辛 7.564 311.4 130 156 18 92 34 IS2 15 磺胺异恶唑 7.666 268.3 100 155.9 12 92.1 30 IS2 16 磺胺苯甲酰胺 8.257 277.2 80 156 12 108 28 IS3 17 磺胺苯吡唑 9.064 315.4 130 65 78 92 43 IS3 18 磺胺地托辛 9.824 311.4 130 156 22 92 38 IS3 19 磺胺喹恶啉 10.277 301.4 110 156.1 16 92.1 36 IS3 IS1 Cis-磺胺吡定 4.444 256 110 162 17 - IS2 Cis-甲氧苄啶 5.415 294 120 230 38 - - IS3 Cs-磺胺地托辛 9.824 317 130 162 21 一 一 IS4 C-磺胺甲二唑 5.844 277 90 2 28 样品前处理程序的优化 本方法选用 Agilent Bond Elut PPL SPE柱 0-2mL2-4mL 富集和净化水中的磺胺类药物。最初，将未经 pH 调节的纯水加载到 PPL 柱上，然后选择含2%氨水的甲醇从柱上洗脱分析物。图2显示了经过第一次2mL洗脱和第二次2mL 洗脱后收集的分析物的测试结果。除磺胺噻唑的总回收率为 54.3%外，所有其它分析物的总洗脱回收率均高于75%。考虑到磺胺噻唑的 pKa 约为7.0，对样品的 pH 进行考察。如图3所示，当上样分析物为20 ng/L时，在pH=6.0的条件下，所有磺胺类药物的回收率均高于80%，而pH=9.0时大部分分析物的回收率均很低。对 pH的进一步详细考察表明，当pH在4-7的范围内时，均 图2.在分步洗脱 SPE 柱得到的各分析物的累积回收率 可获得令人满意的回收率。因此，在将水样加载到 SPE 小柱上进行浓缩和净化之前，需要将水样的 pH 调节至4-7的范围内。 方法的线性和灵敏度 利用浓度为0.5、 1、、2、5、10、20、50、100、200 pg/L 的磺胺类药物的甲醇溶液对方法的线性范围进行评估。采用同位素标记的内标法进行校准，以减小由基质干扰效应引起的定量偏差。如图4所示，所测试的磺胺类药物均表现出优异的线性，回归系数(R)都高于0.996。 基于最低校准浓度 0.5 pg/L 下获得的提 取 MRM色谱图，估算得出每个分析物在该浓度下的信噪比 (S/N)。结果表明，当使用6470 LC/MS/MS 时，各磺胺类药物的 S/N 均大于10，范围为21-101(图5)。对于 UlItivo LC/MS/MS， 除了四种分析物的S/N 值略低于10外，其它分析物的 S/N 均高于10，不过与6470LC/MS/MS相比，大多数分析物的 S/N较低(图5)。考虑到富集倍数为500，经有效富集后，使用6470 LC/MS/MS 和Ultivo LC/MS分别能够可靠地检测500 mL水中浓度低至1ng/L和2ng/L的分析物。 图3.不同 pH水样富集和净化后回收率的比较 图4.应用6470 LC/MS/MS 和 Ultivo LC/MS/MS 测定水中磺胺类药物的线性比较(R)。注：浓度范围： 0.5-200pg/L；分析物序号(X轴)同图1B的洗脱顺序，相应名称见表1 ●6470 图5.最低校准浓度(0.5 ug/L) 下各种磺胺类药物的灵敏度 (S/N)。注：分析物序号(X轴)同图1B的洗脱顺序，相应名称见表1；色谱峰的噪音(N)基于峰峰算法得出 方法准确度与精密度 在500mL水中分别添加10、100、200 ng磺胺类药物(相应浓度分别为20、200、400 ng/L)，对方法的准确度和精密度进行评估。图6显示，大多数添加回收率值在70.5%-96.4%的范围内，只有加标浓度为 20 ng/L 的磺胺异恶的的回收率偏低，略低于60%，另外三个回收率值在63.0%-69.7%的范围内。所有分析物的RSD 均在 0.3%-12.3%的范围内。结果表明，该方法具有良好的准确度和可靠性。 图6.纯水中不同加标浓度下磺胺类药物的回收率与精密度 将 10 ng 磺胺类药物加入500 mL地表水(采集自当地河流)，对应的样品中的加标浓度为20 ng/L， 按照前述方法对加标样品进行前处理，并对回收率和精密度进行评估。表2所示，所有19种分析物的加标回收率均在80.2%-89.5%的范围内， RSD 低于 20%(n=4)， 表明该方法适用于地表水中该类分析物的检测。 本研究展示了一种同时测定水中19种痕量磺胺类抗生素的 SPE-UHPLC/MS/MS方法。无论采用 Agilent 6470 LC/MS/MS还是Agilent Ultivo LC/MS/MS， 该方法均具有线性关系良好、灵敏度高、准确度和精密度高的特点，并符合中国 GB/T27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中规定的标准。采用环境水基质对该方法的进一步评估表明，该方法能够可靠用于地表水中磺胺类药物的常规监测。 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 表2.地表水基质中加标浓度为 20 ng/L 的分析物的回收率和精密度(N=4) 序号 名称 平均回收率(%) RSD (%) 1 磺胺醋酰 83.1 18.9 2 磺胺嘧啶 85.4 15.4 3 磺胺噻唑 85.6 16.4 4 磺胺吡啶 88.1 17.5 5 磺胺甲嘧啶 84.5 14.7 6 甲氧苄啶 89.5 16.9 7 磺胺甲氧哒嗪 82.4 15.6 8 磺胺甲二唑 82.9 14.7 9 磺胺二甲嘧啶 83.3 16.2 10 磺胺对甲氧嘧啶 81.9 15.5 11 磺胺氯哒嗪 81.7 14.9 12 磺胺甲恶唑 80.2 11.6 13 磺胺间甲氧嘧啶 82.0 14.6 14 磺胺多辛 83.1 15.1 15 磺胺异恶唑 81.8 13.3 16 磺胺苯甲酰胺 81.6 12.9 17 磺胺苯吡唑 80.3 15.4 18 磺胺地托辛 80.8 16.9 19 磺胺喹恶啉 80.7 16.5 ( 参考文献 ) ( 1. D anner，M.-C. et al.AntibioticPollution in Surface Fresh Waters：Occurrence and E f fects. Sci. Total Environ. 2019， 644，793-804 ) 2. Zhang，Q.-Q. et al. Comprehensiveevaluation of antibiotics emissionand fate in the river basins ofChina： source analysis， multimediamodeling， and linage to bacterialresistance. Environ. Sci. Technol.2015，49，6772-82 ( 3. Wang， D . et al. Pharmaceutical and P ersonal C are Products i n the Surface Water of China： A Review (in Chinese). Chin. Sci. Bull. (Chin . ) 2014， 59，743-751，doi： 10.1360/972013-370 ) ( 4. USEPA M ethod 1694： Pharmaceuticals and Personal Care Products in Water，Soil， Sediment，and Biosoilids by HPLC/MS/MS， 2007 ) ( 5. China GB/T 27417-2017：ConformityAssessment-Guidance on Validation and Verification of Chemical Analysis Method， 2017 ) 研究发现环境水体中抗生素污染相当广泛，包括磺胺类抗生素。本应用简报介绍了 一种将固相萃取 (SPE) 与液相色谱-串联四极杆质谱 (LC/MS/MS) 联用来测定水中磺 胺类抗生素的可靠方法。所述的 LC/MS/MS 方法在纯水中线性关系良好，在测试 的 0.5–100 µg/L 浓度范内，19 种磺胺类化合物的线性回归系数均高于 0.996。 这些化合物的方法定量限 (LOQ) 值 (S/N = 10) 均处于 2 ng/L 或以下的水平。纯水中 浓度为 20、200 和 400 ng/L 的加标回收率测试表明，大多数化合物的回收率值在 70.5%–96.4% 的范围内，RSD (n = 6) 低于 15%。以地表水为基质，在 20 ng/L 的浓 度水平进行加标回收测试，所有分析物的加标回收率均在 80.2%–89.5% 的范围内， RSD 低于 20%。这些结果表明，所开发的方法灵敏、准确、可靠，可以用于实际环 境地表水的分析。