乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺检测方案(二手分析仪器)

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食品科学※分析检测2010， Vol.31， No.06180 三重四极杆气质联用法分析乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺 李东刚，鞠福龙，李春娟 (黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江哈尔滨 150050) 摘 要：建立三重四极杆气相色谱质谱联用分析乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺的方法。样品以甲醇提取，利用衍生化试剂 BSTFA-TMCS(99：1，V/V)进行衍生化处理、优化仪器条件、考察基质效应，利用三重四极杆气质联用的多反应监测(MRM)技术，对三聚氰酸和三聚氰胺衍生物进行定性定量分析，以三聚氰酸衍生物离子对 m/z 345>215、m/z 345>330离子对进行定性，以m/z 345 > 215进行定量；以三聚氰胺衍生物离子对 m/z 342>171、m/z 342 > 327 离子对进行定性，以 m/z 342> 327进行定量。方法在0.010~0.500mg/L范围内呈良好的线性关系。方法分析三聚氰酸和三聚氰胺的检测限分别为0.016、0.003mg/kg，精密度为4.5%~8.6%、3.9%~6.2%和回收率分别为84.0%~102.0%、88.5%~104.0%。为乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺的检测提供了准确可靠的方法。 关键词：：三重四极杆气质联用；；多反应监测；衍生化；乳粉；三聚氰酸；三聚氰胺 Gas Chromatography Tandem Triple Quadrupole Mass Spectrometric Determination of Cyanuric Acid andMelamine in Milk Powder LI Dong-gang， JU Fu-long， LI Chun-juan (Academy of Quality Inspection and Research in Heilongjiang Province， Harbin 150050， China) Abstract ： A gas chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometric (GC-QqQ-MS/MS) method was presentedfor the determination of cyanuric acid and melamine in milk powder. Samples were extracted with methanol and derivatized witha mixed system composed of BSTFA and TMCS (99：1， V/V)prior to GC-QqQ-MS/MS analysis in multiple reaction monitoring(MRM) mode. The optimal values of crucial instrument parameters and matrix effects were investigated. Cyanuric acid wasqualified using the ion pairs of m/z 345> 215 and m/z 345 > 330 and quantified using the ion pair of m/z 345> 215. Melaminewas qualified using the ion pairs of m/z 345>171 andm/z 342>327 and quantified using the ion pair ofm/z 342>327. The developedmethod exhibited good linearity within the range of 0.010 to 0.500 mg/L. Limit of detection was 0.016 for cyanuric acid and0.003 mg/kg for melamine (Rsn =3). Precision RSDs for determining cyanuric acid and melamine were within the ranges of4.5%一8.6% and 3.9%一6.2%， respectively. Recoveries of cyanuric acid and melamine in an infant formula milk power samplespiked at two levels were ranged from 84.0% to 102.0% and from 88.5% to 104.0%， respectively. Key words： gas chromatography tandem triple quadruple mass spectrometry (GC-QqQ-MS/MS)； multiple reactionmonitoring (MRM) mode； derivatization； milk powder； cyanuric acid； melamine 中图分类号：0657.63 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)06-0180-05 三聚氰酸和三聚氰胺安属非蛋白类含氮有机化学品，并非食品添加剂。三聚氰胺分子结构中含有多个氮原子，氮含量高达67%，因此，不法分子掺加三聚氰胺到食品中以达到提高蛋白含量的目的，而三聚氰酸作为原料常用于有机合成，三聚氰胺可在一定条件下逐步转 化为三聚氰酸。根据文献介绍12]，三聚氰酸和三聚氰胺具有一定的危害，我国已禁止将两者掺入到食品中，尤其是乳品中。根据文献检索，同时测定三聚氰酸和三聚氰胺的方法有气相色谱-质谱联用法!3]、液相色谱-质谱联用法[4-5]、我国也制定了检测三聚氰胺及类似物的国 ( 基金项目：黑龙江省科学技术厅科技攻关计划项目(GZ08A405) ) ( 作者简介：李 东 刚(1976一)，男，高 级 工程师，本科， 主 要从事 仪 器分析测试方法研究。E-mail： lidg86@yahoo.com.cn ) 家标准I6]和乳制品中三聚氰胺的检测标准I7]，但尚未建立乳粉三聚氰酸和三聚氰胺的检测标准。不同于文献方法I3]，实验室确定了以甲醇为提取溶剂，结合涡旋混合以及超声波提取手段提取三聚氰酸和三聚氰胺，然后采用衍生化方法，通过优化仪器参数，考察基质效应，利用三重四极杆气相色谱质谱联用(GC-MS/MS)的多反应监测技术(multiple reaction monitoring， MRM)建立同时分析乳粉三聚氰酸和三聚氰胺的定性定量检测方法，考察方法的线性范围、检测限、精密度、回收率4个技术指标及其应用效果。 材料与方法 1.1 材料、试剂与仪器 婴幼儿1段奶粉、2段奶粉、3段奶粉，全脂奶粉、中老年奶粉 市售。 三聚氰酸标准品(纯度>99.0%) Dr Ehrenstorfer 公司；；三聚氰胺标准品(纯度99.6%±0.5%) 中国计量科学研究院；衍生化试剂为BSTFA-TMCS(99：1， V/V)REGIS公司；甲醇、吡啶(均为色谱纯)。 Varian 320-MS气相色谱-质谱联用仪(配CP-8400型自动进样器)、VF-5MS色谱柱(30m ×0.25mm，0.25um) 美国瓦里安公司； KQ5200DE型超声波提取仪昆山市超声仪器有限公司；XK96-A快速混匀器 姜堰市辛康医疗器械有限公司。 1.2 方法 1.2.1 仪器条件 色谱条件：载气：氦气(纯度99.9995%)；柱流速：1.0mL/min；汽化室温度：260℃；进样方式：不分流；进样量：：11.0uL；柱温程序：初始温度90℃保持 1min：以12℃/min 速率升温至200℃保持14min， 总运行时间为24min。 质谱条件：传输线温度：240℃；离子源温度：240℃；离子化方式：EI；电离能量：70eV；溶剂延迟时间：6min；质谱采集时间：16min；EDR电压：1200V；碰撞气：高纯氩气(纯度99.999%)；碰撞气压力：1.5mtorr；质谱扫描方式：多反应监测(MRM)；三聚氰酸母离子m/z 345、子离子 m/z 330、215、三聚氰胺衍生物母离子m/z 342、子离子m/z 327、171。 1.2.2 三聚氰酸、三聚氰胺标准溶液的配制 1.2.2.1 标准物质储备溶液 分别准确称取0.02g三聚氰酸和三聚氰胺标准物质于100mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，分别配制成含三聚氰酸、三聚氰胺单组分标准物质储备溶液，其中三聚氰酸、三聚氰胺的质量浓度为 200mg/L。然后稀释成10.0mg/L 次级标准储备液。 1.2.2.2 标准工作溶液 三聚氰酸标准工作溶液：准确移取一定量的10.0mg/L三聚氰酸次级标准储备液，以甲醇逐级稀释，配制成含三聚氰酸0.010、0.020、0.050、0.10、0.20、0.50mg/L标准工作溶液。 三聚氰胺标准工作溶液：：准确移取一定量的10.0mg/L三聚氰胺次级标准储备液，以甲醇逐级稀释，配制成含三聚氰胺0.010、0.020、0.050、0.10、0.20、0.50mg/L 标准工作溶液。 三聚氰胺、三聚氰酸混合标准溶液：准确移取一定量的10.0mg/L三聚氰胺和三聚氰酸次级标准储备液，以甲醇逐级稀释，配制成含三聚氰酸、三聚氰胺0.010、0.020、0.050、0.10、0.20、0.50mg/L标准工作溶液。 1.2.3 样品处理 1.2.3.1 样品提取 取均匀乳粉样品0.5g(精确至0.0001g)于10mL具塞比色管中，准确加入5.0mL甲醇，先涡旋混合2min，然后在超声波提取仪上提取 25min， 以5000r/min 转速离心，收集上清液并过 0.45um滤膜，制得提取液。分别取200uL样品提取液于自动进样瓶在60℃水浴氮气吹扫至干；另取各标准工作系列200uL于自动进样瓶中在60℃水浴氮气吹扫至干，按1.2.3.2节进行衍生化处理，同时作空白实验。 1.2.3.2 衍生化 在上述氮气吹扫至干的自动进样瓶中，加入0.30mL吡啶，涡旋5s，再加入衍生化试剂0.20mL，涡旋5s，盖好密封，置于70℃干燥箱内衍生处理45min，取出冷却待测。 2 结果与分析 2.1 提取方法的选择 2.1.1 提取溶剂 三聚氰酸和三聚氰胺属强极性的化合物，根据对两者分子结构及理化性质的分析，采用强极性溶剂或酸碱可使其溶解。三聚氰酸和三聚氰胺在酸碱介质中不稳定、存在化学反应，生成其他的衍生物，为保证两者稳定，实验室未选用酸碱作为提取溶剂；结合乳粉体系，对水、甲醇、乙腈以及一定比例的水-甲醇、水-乙腈体系对三聚氰酸以及三聚氰胺的溶解性以及对乳粉体系的分离效果，实验最终确定以甲醇作为乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺的提取溶剂。 2.1.2 提取方法 根据超声波法在三聚氰酸、三聚氰胺检测中的应用文献[2-7]，实验选定了以旋涡混合器和超声波提取仪配 合使用作为提取乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺的方法。在涡旋混合时间为2min 条件下，比较了样品在5、10、15、20、25min的提取效率，结果表明：超声提取时间为5min时，提取效率约65%；超声提取时间为 15min时，提取效率约75%；超声提取时间为20、25min时提取效率超过80%；实验最终确定提取方法为涡旋混合时间2min、超声提取时间为25min。 2.2 三聚氰酸和三聚氰胺共存时的影响 通过实验，，当三聚氰胺和三聚氰酸的混合标准溶液中的质量浓度均为 5.0mg/L以下时，溶液澄清透明；当混合标准溶液质量浓度超过 6mg/L时，溶液开始变浑浊，静置后底部有白色不溶物；随着质量浓度的增加，浑浊现象更加明显。实验通过峰面积以及标准工作曲线的相关性考察了三聚氰酸、三聚氰胺单组分标准工作溶液和混合标准工作溶液的差异，结果表明，三聚氰酸和三聚氰胺在0.010~0.50mg/L质量浓度范围内共存，相互没有影响。 2.3 三聚氰胺和三聚氰酸的定性离子对的选择 利用选择反应监测(selected reaction monitoring，SRM)对三聚氰酸和三聚氰胺的衍生物的裂解方式进行了实验，获得了两者在不同碰撞能5、10、15、35V条件下的质谱图。三聚氰酸和三聚氰胺的定性离子的选择主要从两者衍生物在不同碰撞能下碎片离子构成以及对基体干扰分析的情况下获得。 通过对乳粉基体的分析， m/z 330、147是三聚氰酸衍生物一级质谱中主要的碎片例子，但通过实验发现，m/z 147碎片离子存在较严重的基体干扰，质量色谱图中分离效果差，而m/z 330基体干扰较小；三聚氰酸衍生物在5V碰撞能作用下，产生m/z 215特征离子，通过实验验证， m/z 215干扰小，所以最终确定三聚氰酸衍生物的定性离子对为 m/z 345 > 330、m/z 345>215。而对于三聚氰胺，通过文献[7]及实验确定 m/z 342 >327、m/z 342>171为定性离子对。定性方法采用与标准物质比较，在多反应监测(MRM)色谱图中，保留时间变化在2.5%，离子对相对丰度比例变化在20%范围内即可定性确认。 2.4 三聚氰酸和三聚氰胺衍生物二级质谱碰撞能的优化 利用多反应监测(MRM)扫描技术，分别对三聚氰酸衍生物离子对 m/z 345 >215、m/z 345>330和三聚氰胺衍生物离子对 m/z 342>171、m/z 342>327在3、5、10、15、20、25、30V的不同碰撞能条件下离子对的峰面积进行正交试验，通过考察离子对最大峰面积从而确定碰撞能最优值。结果表明：三聚氰酸衍生物离子对m/z 345 >215、m/z345>330的最优碰撞能分别为5V和5V，三聚氰氰衍生物离子对 m/z 342>171、m/z 342 > 327的最优碰撞能分别为 25V 和10V。两者衍 生物中离子对的相对丰度分别为63%、73%，实验选定以离子对 m/z 345>215 和 m/z 342 > 327进行定量。在建立的条件下混合标样的MRM 总离子流图见图1，三聚氰酸、三聚氰胺衍生物的质谱图见图2. 1.三聚氰酸衍生物(t=9.69min)； 2.三聚氰胺衍生物(t=13.01min)。 图1 三聚氰酸、三聚氰胺混合标样衍生物 MRM总离子流图 Fig.1TIC chromatogram of derivatized mixed cyanuric acid andmelamine standards in MRM mode a.三聚氰酸衍生物；b.三聚氰胺衍生物。 图2 三聚氰酸衍生物、三聚氰胺衍生物的质谱图 Fig.22Mass spectra of derivatized cyanuric acid (a) and melamine(b) standards 2.5 乳粉基质对三聚氰酸和三聚氰胺检测的影响 实验通过基质匹配标准系列和空白基质加入低含量标准物质提取两种方法考察乳粉基质对三聚氰酸和三聚氰胺测定的影响。 2.5.1 基质匹配标准溶液 实验选定婴幼儿1段奶粉、2段奶粉、3段奶粉、全脂奶粉、中老年奶粉及甲醇体系6种不同基体，考察基体对三聚氰酸和三聚氰胺检测的影响。通过实验筛选出其中不含三聚氰酸和三聚氰胺的上述5种奶粉，按照1.2.3.1节制备基质溶液，并以此配制成标准工作溶液，利用定量离子峰面积S对质量浓度 c(mg/L)绘制标准工作曲线，结果见表1。 方程的斜率可以看出，基质不同对于分析三聚氰酸和三聚氰胺影响较小，不同基质的线性关系均良好。 表1 不同基质下的标准工作系列线性方程和相关系数 Table 1 Linear equations and correlation coefficients for determination of cyanuric acid and melamine in different matrixes 基质种类 三聚氰酸线性方程 相关系数 三聚氰胺线性方程 相关系数 甲醇 S=3.26×10c+5900 0.9984 S=4.31×10c+117890 0.9990 1段奶粉 S=3.35×10c-1689 0.9979 S=4.24×10c-79846 0.9986 2段奶粉 S=3.29 ×10c+3657 0.9980 S=4.37×10c-63657 0.9982 3段奶粉 S=3.26×10c-5423 0.9986 S=4.45×10c-105423 0.9981 全脂奶粉 S=3.32 ×10c-1431 0.9981 S=4.36×10c-71431 0.9990 中老年奶粉 S=3.40×10c-3440 0.9979 S=4.29×10c+66440 0.9984 2.5.2 基质加标实验 为了考察空白乳粉基质对于检测三聚氰酸以及三聚氰胺的影响，以空白全脂乳粉为研究对象，按样品处理过程，基质加标水平为 0.020mg/kg， 在上述条件下测试，获得m/z 345>215(三聚氰酸)、m/z 342>327(三聚氰胺)的 MRM 色谱图见图3. 1.三聚氰酸衍生物(tR=9.70min)； 2.三聚氰胺衍生物(tr=13.04min)。 图3 空白乳粉基质加标0.020mg/kg MRM 色谱图(m/z 345>215，m/z 342 >327) Fig.3 Chromatogram of a blank milk powder sample spikedcyanuric acid and melamine at the level of 0.020 mg/kg(extracted m/z 345>215， m/z 342 >327) 通过空白基质加标水平为 0.020mg/kg的多反应监测MRM的色谱图(m/z345>215、m/z342>327)看出加入低水平的三聚氰酸和三聚氰胺均有良好的信噪比。从基质匹配标准溶液线性以及空白基质加标实验结果分析，利用甲醇提取乳粉中三聚氰胺和三聚氰酸，并对两者进行衍生化处理，结合三重四极杆气相色谱质谱联用的，仪器条件分析三聚氰酸和三聚氰胺，基质效应影响小。 2.6 方法的线性关系、检测限和精密度、回收率 2.6.1 标准工作曲线、线性范围和检测限 按照上述方法提取三聚氰胺衍生物特征离子，在0.01~0.50mg/L范围内以定量离子的峰面积S对质量浓度c作图，绘制标准工作曲线，计算相关系数，实验数据如表1所示，方法在0.01~0.50mg/L范围内呈良好线性。以信噪比RsN=3计，三聚氰酸、三聚氰胺的仪 器最小检测质量浓度为 0.0016、0.00027mg/L，依据实验过程计算，方法检测三聚氰酸和三聚氰胺的检测限为0.016、0.003mg/kg. 2.6.2 精密度、回收率实验 分取制备均匀的婴幼儿配方乳粉样品18份，其中6份做空白实验考察本底，6份添加三聚氰酸、三聚氰胺的水平均为 0.20mg/kg， 另6份三聚氰酸、三聚氰胺添加水平均为2.00mg/kg。利用上述方法进行提取测定，以扣除空白的实测添加量相对标准偏差表征方法的精密度，以扣除空白的实测添加量与实际添加量的比值作为回收率，结果见表2、3。从实验数据分析可以看出，方法的回收率以及精密度均满足要求。 表2 三聚氰酸的回收率、精密度实验结果(n=6) Table 2 Precision RSDs for determining cyanuric acid and itsrecoveries in an infant formula milk power sample spiked at twolevels (n=6) 本底值 加标水平0.20mg/kg 加标水平2.00mg/kg 序号三聚氰酸/平均值/精密实测添加回收率/精密度/实测添加回收率/精密度/ (mg/kg) (mgkg) 度/%量/(mg/kg) % %量/(mg/kg) % % 1 0.211 0.183 91.5 1.84 92.0 2 0.192 0.168 84.0 2.01 100.5 3 0.217 0.198 8.6 0.176 88.0 6.2 1.85 92.5 4.5 4 0.179 0.182 91.0 1.98 99.0 5 0.178 0.186 93.0 1.88 94.0 6 0.209 0.202 101.0 2.04 102.0 表3 三聚氰胺方法的回收率、精密度实验结果(n=6) Table 3 Precision RSDs for determining melamine and itsrecoveries in an infant formula milk power sample spiked at twolevels (n=6) 本底值 加标水平0.20mg/kg 加标水平2.00mg/kg 房 }三聚氰胺/平均值/ 精密度/ 实测添加 回收率/精密度/ 实测添加 回收率/精密度/ (mg/kg) (mg/kg) % 量/(mg/kg) % % 量/(mg/kg) % % 0.591 0.192 96.0 1.86 93.0 0.561 0.208 104.0 1.77 88.5 0.538 70.565 3.9 0.18 93.5 6.2 1.90 95.0 5.2 4 0.571 0.180 90.0 1.78 89.0 0.587 0.178 89.0 2.04 102.0 6 0.543 0.201 100.5 1.89 94.5 2.7 样品测定 图4 典型样品MRM 色谱图(m/z 345>215、m/z 342>327) Fig.4 Chromatogram of milk powder sample (extracted m/z 345 >215， m/z 342> 327) in MRM mode 利用建立的方法对20个乳粉样品进行测试，三聚氰酸残留量在0~0.40mg/kg，三聚氰胺残留量在0~0.70mg/kg之间，典型样品 MRM 色谱图见图4。 3 结 论 通过实验确定了乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺的提取溶剂、提取方法，为提高三聚氰酸和三聚氰胺挥发性，利用BSTFA-TMCS(99：1，V/V)试剂进行衍生化处理，另外通过三重四极杆质谱的 MRM 检测技术建立了三聚氰酸和三聚氰胺的定性定量检测方法，并通过基质匹配标准曲线、空白基质加标考察了乳粉的基质效应，建立的方法应用于乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺的检测效果良好。 ( 参考文献： ) ( 王 箴.化工词典[M].北京：化学工业出版社，2008：795. ) ( WHO. Me l amine and cyanuric acid： toxicity， preliminary risk assess-ment and guidance on levels in food[EB/OL]. ( 2008-09-25) [2008-12- 1 0].http：//www.who.int/entity/foodsafaty/fs _ m anagement/infosan _ eve n ts/ en/index.html. ) ( [3] FDA. GC-MS screen for the presence of melamine， ammeline， ammelide a nd cyanuric acid[EB/OL].(2008-10-28)[2008-12-10].http：//www.fda.gov/cvm/gcmsmelamine.html. ) ( [4] F DA. I n terim method for determination of melamine and cyanuric acid residues in food s using LC-MS/MS： version 1.0[EB/OL]. ( 2008-10-19) [2008-12-10]. http：//www.cfsan.fda.gov/~frf/lib4422. html. ) ( [5] FDA. Determination of melamine and cyanuric acid residues in i n fant f ormula using L C-MS/MS[EB/OL].(2008-10-17)[2008-12-10]. http：// www.cfsan.fda.gov/~frf/lib4421. html. ) ( [6] GB/T 22288—2008植物源产 品 中三聚氰胺 、 三聚氰酸 一 酰胺、 三 聚氰酸二 酰 胺、三 聚 氰酸的测定气相色谱-质谱法[S]. ) ( [7] GB/T223882008原料乳与乳制品中 三 聚氰胺检测方法[S]. ) 建立三重四极杆气相色谱质谱联用分析乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺的方法。样品以甲醇提取，利用衍生化试剂 BSTFA-TMCS（99:1，V/V）进行衍生化处理、优化仪器条件、考察基质效应，利用三重四极杆气质联用的多反应监测（MRM）技术，对三聚氰酸和三聚氰胺衍生物进行定性定量分析，以三聚氰酸衍生物离子对 m/z 345 ＞215、m/z 345 ＞ 330 离子对进行定性，以 m/z 345 ＞ 215 进行定量；以三聚氰胺衍生物离子对 m/z 342 ＞ 171、m/z 342 ＞ 327 离子对进行定性，以 m/z 342 ＞ 327 进行定量。方法在 0.010～0.500mg/L 范围内呈良好的线性关系。方法分析三聚氰酸和三聚氰胺的检测限分别为 0.016、0.003mg/kg，精密度为 4.5%～8.6%、3.9%～6.2% 和回收率分别为 84.0%～102.0%、88.5%～104.0%。为乳粉中三聚氰酸和三聚氰胺的检测提供了准确可靠的方法。