二甲双胍及相关制剂中N-亚硝基二甲胺检测方案(液质联用仪)

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使用 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统定量分析二甲双胍及相关制剂中的N-亚削基二甲胺 本应用报告介绍了采用 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统检测二甲双胍及相关制剂中的N-亚硝基二甲胺 (NDMA)的方法。该方法采用常规反相体系，重现性好、特异性强，且灵敏度优于目前的 NDMA 法规限量要求(96ng/天)，适用于对二甲双胍原料药(一般为盐酸二甲双胍)及市面所见的二甲双胍类制剂(片剂、胶囊、肠溶片和缓释剂等)中的NDMA 进行快速、准确的定量分析。 在经历全球范围内对胃药雷尼替丁及沙坦类降压药中N-亚硝基二甲胺(NDMA)致癌物污染的恐慌之后，监管机构对其它可能遭受污染的化学合成药物越来越警惕。2019年12月，美国食品药品监督管理局(FDA) 披露，“正在进行二甲双胍中致癌物检测的初级阶段，尚未证实其中所含的 NDMA 是否高于可接受的每日摄入量96纳克的限定值”。随后，除美国外，新加坡、欧洲、加拿大以及我国的药品监管部门也开始对二甲双胍中NDMA 的含量进行检测，并且在新加坡已有召回案例2。 N-亚硝基二甲胺 (NDMA) 又称二甲基亚硝胺 (CAS 64-75-9)， 结构如图1所示，具有很强的肝脏毒性，属于亚硝胺类遗传毒性杂质。根据世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单， NDMA 属于 2A类致癌物，即“对人很可能致癌，此类致癌物对人致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分”。根据 FDA 之前的评估结果，将 NDMA的可接受限量规定为96 ng/天4。 图1.N-亚硝基二甲胺 (NDMA)结构 关于二甲双胍中 NDMA的检测，新加坡卫生科学管理局(HSA)于2019年12月公布了 GC-MS/MS 方法。同期，我国药品监管部门同时推荐了 LC-MS/MS 和 GC-MS/MS方法，下发给各省市药品检验机构。2020年2月， FDA 在其官网上更新了 LC-HRMS检测方法. 本方法依据中国食品药品检定研究院二甲双胍中 NDMA 推荐检测方法的要求，采用定量的金标准三重四极杆液质联用系统进行测试，操作简单、灵敏度高、特异性强且重现性好，可有效地用于二甲双胍及相关制剂中 NDMA的定量分析。 试剂和样品 甲醇为质谱级，甲酸为色谱级，购自 Merck；所用实验用水为利用Millipore Milli-Q超纯水系统现制备的高纯去离子水； NDMA标准品溶液购自美国o2si；样品由合作用户提供。 仪器和设备 采用 Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色谱系统与6470三重四极杆质谱联用系统，其中色谱系统配备二元泵(部件号 G7120A)、自动进样器(部件号 G7167B)和柱温箱(部件号 G7116B)， 质谱系统配备大气压化学电离 (APCI) 离子源。 为确保高水相体系的耐受性，色谱柱选用 Agilent InfinityLabPoroshell 120 SB-AQ (3.0×150mm，2.7 um， 部件号683975-314)。 标样配制 取 NDMA标准品溶液(1000 mg/L甲容溶液)，用水逐级稀释成每1mL中分别含 1、5、10、50、100ng标准品的溶液，作为校准标样。并将1ng/mL 溶液稀释三倍，作为灵敏度测试溶液。 样品前处理 原料药和非缓释片制剂 称取适量二甲双胍原料药(一般为盐酸二甲双胍)或除缓释片以外的制剂。对于片剂(如盐酸二甲双胍片或二甲双胍肠溶片)，需经过预先研磨；对于盐酸二甲双胍胶囊，则称取内容物。所有样品量经过适当计算，以二甲双胍计约50 mg。加1mL水，摇匀，涡旋混合1 min， 再振摇 10 min， 离心后取上清液进行检测。 如果条件允许，建议实验室放大称量及溶剂倍数，以保证结果准确度，使最终样品溶液浓度为50 mg/mL (以二甲双胍计)。 二甲双胍缓释片 二甲双胍缓释片因辅料影响，不适合用水溶解。建议采用甲醇代替水进行样品前处理，并配合采用甲醇稀释标准品以制备标准标样。 液相色谱条件 色谱柱： Poroshell 120 SB-AQ， 3.0×150 mm， 2.7 um 流速： 0.4mL/min 柱温： 40°℃ 流动相： A) 0.1% 甲酸水溶液 后运行时间： 3min 质谱条件 离子源： APCI离子源 雾化气、干燥气及碰撞气： 氮气 雾化气压力： 50.0 psi 干燥气温度： 300°C 干燥气流速： 5 L/min 蒸发室温度： 350°℃ VCap电压： 1500V 电晕针电流： 6pA 检测模式： 多反应监测(MRM) MRM 参数： 如表1所列 表1.NDMA的MRM 参数 化合物 母离子(m/z) 子离子(m/z) 裂解电压(V) 碰撞电压(V) 极性 NDMA 75 43* 100 15 正 58 12 *定量离子 色谱分离结果 二甲双胍极性很高，在常规反相色谱系统中无保留。为提高色谱系统的适用性和耐用性，本研究选择亲水型反相色谱柱 SB-AQ，起始采用100%水相洗脱二甲双胍及盐酸盐。利用 NDMA 的弱保留性，将其与高浓度二甲双胍分离。在本研究中所用的色谱条件下， NDMA 的保留时间约为4.6min， 随后使用高比例有机相洗脱辅料等物质，结果如图2所示。 由于二甲双胍浓度很高，为避免污染质谱系统，建议建 NDMA出峰前流路中设置“引入废液”。如果制剂比较复杂，则建议在NDMA 出峰后再设置流路“引入废液”，避免辅料的污染。 图2.NDMA的分离和检测，自上而下依次为：阴性肠溶片TIC； 加标1 ng NDMA肠溶片的 TIC； 1 ng NDMA 定量离子对； 1 ng NDMA定性离子对 方法学考察：校准曲线、灵敏度与重现性 将 NDMA 校准标样按浓度由低到高进样。结果发现，在1-100.0 ng/mL 的浓度范围内， NDMA 的线性良好，相关系数R²高于0.99(如图3所示)，每个浓度点的准确度均在90%-110%范围内。 图3.NDMA的校准曲线(1-100.0 ng/mL) 在灵敏度测试中，方法检测下限轻松达到0.3 ng/mL，定量离子信噪比 (peak to peak) 接近 10，同时可以观察到定性离子，结果如图4所示。按照 50 mg/mL (以二甲双胍计)配制二甲双胍原料药及制剂，本方法的灵敏度可达 0.006 ppm， 满足目前日摄入量和 NDMA 的法定限量要求。 图4.0.3 ng/mL NDMA MRM 色谱图：上图为定量离子，下图为定性离子 将中低浓度点(2 ng/mL)校准溶液连续进样6次，以考察评估方法重现性。结果如表2所列。6次进样得到的峰面积相对标准偏差(RSD) 为1.49%， 表明该方法具有良好的重现性。 表2.2 ng/mL NDMA 连续进样6次所得到的峰面积 进样针数 1 2 3 4 5 6 定量离子峰面积 17048 17539 17584 17794 17371 17287 样品处理及加标回收率 本研究分析了盐酸二甲双胍原料药、二甲双胍片、盐酸二甲双胍胶囊、二甲双胍肠溶片和盐酸二甲双胍缓释片。盐酸二甲双胍原料药的水溶性良好，其中的 NDMA 回收率高。将其片剂、胶囊和肠溶片研磨后，采用水溶液提取，加以振摇等辅助手段，在不同加标浓度下得到的回收率均在80%-120%之间(见表3)。 对于二甲双胍缓释片，由于辅料的影响，直接用水溶解将呈“果冻”状，无法继续操作。由于 NDMA 在甲醇中的溶解性良好，且二甲双胍在甲醇中也具有较高的溶解度，因此采用甲醇超声提取二甲双胍缓释片10 min， 所到到的回收率可达90%以上(见表3)。建议缓释片采用甲醇代替水进行样品前处理，并配合采用甲醇稀释标准品制备标准曲线溶液。 表3.不同剂型二甲双胍样品的低浓度加标回收率 剂型 肠溶片 片剂 胶囊 缓释剂 样品中NDMA 含量 N.D. N.D. N.D. 33.27 ng/mL 1 ng/mL加标回收率 105.5% 104.5% 107.2% 10 ng/mL 加标回收率 因为用户给出的缓释剂为阳性样品，NDMA含量很高，故加标10 ng/mL 91.5% N.D.： 未检出 本研究采用配备 APCI 离子源的6470三重四极杆液质联用系统检测二甲双胍及其制剂中的亚硝胺类杂质 NDMA。该方法稳定、特异性强且灵敏度优于目前限量检测要求。考察了不同剂型的成品药，它们经过适当的前处理，均可实现有效分离并使 NDMA 获得80%-120%的加标回收率，准确定量分析低浓度 NDMA。另外，该方法采用反相色谱系统，通用性强且重现性好，通过方法设置将高浓度药品基质引入废液，可减少对质谱系统的污染。因此，非常适合对大批量二甲双胍样品中的 NDMA 进行常规定量分析。 ( 1 . 美国FDA官网： https：//www.fda.gov/drugs/drug-safety-and-availability/fda-updates-and-press-announcements-ndma-metformin ) ( 2. 新加坡HAS 官网： https：//www.hsa.gov.sg/announcements/safety-alert/update-on-impurities-in-metformin-products ) 3.t世界卫生组织国际癌症研究机构致癌物清单：http：//samr.cfda.gov.cn/WS01/CL1991/215896.html 4.美国FDA官网： ( https：//www.fda.gov/drugs/drug-safety-and-availability/fda-updates-and-press-announcements-angiotensin-ii-receptor- blocker-arb-recalls-valsartan-losartan ) 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 免费专线： 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) 联系我们： LSCA-China_800@agilent.com 在线询价： www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com 安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供、展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任。 ( 本文中的信息、说明和技术指标如有变更，恕不另行通知。 ) ( 5994-2207ZHCN ) 本应用报告介绍了采用 Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统检测二甲双胍及相关制剂中的 N-亚硝基二甲胺 (NDMA) 的方法。该方法采用常规反相体系，重现性好、特异性强，且灵敏度优于目前的 NDMA 法规限量要求（96 ng/天），适用于对二甲双胍原料药（一般为盐酸二甲双胍）及市面所见的二甲双胍类制剂（片剂、胶囊、肠溶片和缓释剂等）中的NDMA 进行快速、准确的定量分析。