单克隆抗体 (mAb)中关键质量属性 (CQAs)检测方案(液相色谱仪)

智能文字提取功能测试中

表2.LC/MS条件 应用简报 Agilent生物制药Trusted Answers 单克隆抗体多个关键质量属性的评估和可比性评估 Suresh Babu C.V. 和Brian Liau 安捷伦科技有限公司 基于多属性方法(MAM) 的 LC/MS 肽谱分析在生物制药分析领域受到了广泛的关注。本应立简报展示了使用 LC/MS肽谱分析方法对不同单克隆抗体(mAb)的关键质量属性 (CQAs) 进行的表征和定量分析。将肽谱分析结果与传统方法进行了比较，结果表明，肽谱分析与传统方法对赖氨酸截短、氧化、脱酰氨基化、N端环化和糖基化程度的估算高度相似。 前言 单克隆抗体(mAbs) 来自正处于快速生长期的生命系统。由于其生物来源，这些复杂分子在生产过程中会经历各种翻译后修饰(PTMs)，从而导致明显的异质性。在mAbs 的开发和生产过程中，将这些意外修饰作为CQAs 进行表征和监测至关重要。由于每种 CQA 的化学性质不同，传统上有几种检测方法可执行此分析，每种技术都有各自的优缺点。近年来，基于LC/MS 的多属性方法(MAM)获得了广泛的应用，因为它有望提供一种对 mAbCQAs 进行全面表征的单一方法，与传统方法相比，该方法可有效节省分析时间和成本。然而，在将 MAM 方法应用于严格监管的质量控制环境之前，必须先验证传统分析方法与肽谱分析结果的对应准确性。重要的是确保肽谱分析工作流程可提供与传统分析方法相当的结果。 本研究比较了肽谱分析方法与传统分析方法(包括离子交换色谱法、亲水相互作用色谱法 (HILIC) 和亚基水平反相色谱法)的性能。使用由 Agilent AssayMAPBravo 液体处理平台、Agilent 1290Infinity ll 液相色谱系统和 Agilent 6545XTAdvanceBio LC/Q-TOF， 以及用于数据分析的 Agilent MassHunter BioConfirm 软件组成的一体化工作流程对 mAbs 进行了肽谱分析。比较了肽谱分析方法与传统分析方法对各 CQA 的相对(%)定量结果。 实验部分 材料 mAb1、mAb2和mAb3 购自当地经销商(新加坡)，并根据制造商的使用说明进行储存。三羟甲基氨基甲烷、、TTris-HCI、盐酸胍、三(2-羧乙基)膦 (TCEP)、碘乙酰胺 (IAA)、甲酸、三氟乙酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠和 LC/MS 级溶剂购自 Sigma-Aldrich。 IdeS 蛋白酶购自Genovis。高品质测序级胰蛋白酶来自安捷伦科技公司。 自动化 Agilent AssayMAP Bravo液体处理平台 (G5542A) 液相色谱系统 Agilent 1260 InfinityⅡI生物惰性液相色谱系统 · Agilent 1260 Infinity ⅡI生物惰性泵(G5654A)· Agilent 1260 Infinity Ⅱl 生物惰性 Multisampler (G5668A)，配备样品冷却装置 · Agilent 1260 Infinity ⅡI高容量柱温箱 (G7116A)，配备生物惰性热交换器·Agilent 1260 Infinity 生物惰性 ·分析型馏分收集器 (G5664A) Agilent 1290 Infinity ll液相色谱系统 · Agilent 1290 Infinity ll高速泵 (G7120A)· Agilent 1290 Infinity Ⅱl高容量柱温箱 (G7116B) · Agilent 1290 Infinity II Multisampler (G7167B) 检测 · Agilent 1260 Infinity Ⅱ二极管阵列检测器WR(G7115A)，配备生物惰性流通池· Agilent 1260 Infinity 荧光检测器(G1321B) · Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 色谱柱 · Agilent Bio MAb， 无孔，4.6×250 mm， 5 pm HPLC， PEEK · Agilent ZORBAX RRHD 300 SB-C18，2.1×100 mm， 1.8 pm · Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱， 2.1×150 mm，1.8pm · Agilent AdvanceBio 肽谱分析色谱柱，2.1×150 mm， 2.7 pm， 120 A 软件 · Agilent OpenLab CDS 2.3版 ·安捷伦缓冲液顾问软件 A.01.01 [009] ·Agilent OpenLAB CDS ChemStation版，适用于液相色谱系统，修订版 C.01.07· Agilent MassHunter 采集软件 (B.10.00) · Agilent MassHunter BioConfirm 10.0 ·Agilent VWorks 自动化控制13.1.1.1383 实验方法 电荷异构体：将样品直接进样，无需稀释(10 mg/mL)。表1和表2列出了 mAb1和 mAb2 针对弱阳离子交换 (WCX)色谱法的色谱参数。对收集的 WCX 馏分进行了胰蛋白酶酶解和肽谱分析。 氧化：将5pLmAb样品(2mg/mL， 溶于Tris-HCI缓冲溶液)加入5 pL IdeS 蛋白酶中，30℃下孵育30分钟，冷却至室温后进行分析。 游离多聚糖：使用 AssayMAP Bravo 液体处理系统和 GlykoPrep 快速N-糖试剂盒(GPPNG-PC)进行标记 N-糖样品前处理2。通过 HILIC实现标记N-糖的分离。 胰蛋白酶酶解 将收集的 WCX样品和 mAb 样品馏分还原/烷基化，并用胰蛋白酶酶解，然后使用 Agilent AssayMAP Bravo 液体处理平台对其进行脱盐处理3。简而言之，将含有 mAbs 的品品板复溶于变性缓冲液(含5mmol/L TCEP 和 150 mmol/LTris 的 8 mol/L 盐酸胍， pH8) 中，并 在 60℃下温育60分钟。在进行变性和二硫键还原后，加入133 mmol/L 碘乙酰胺(室温下40分钟)对游离的半胱氨酸进行烷基化。然后将样品酸化并用1.75%TFA 进行稀释。接下来，使用 RP-W小柱对样品进行蛋白质纯化应用，并在37°℃下进行胰蛋白酶过夜酶解(蛋白质与蛋白酶比例 20：1， w：w)。随后，通过AssayMAP 试剂转移工具使用0.1%甲酸对样品进行酸化，1以终止胰蛋白酶的活性。使用 C18反相柱执行 AssayMAPBravo肽段纯化方案(脱盐)。 表1.液相色谱条件 参数 WCX (C 端赖氨酸、N端环化异构体和脱酰氨基化) RP (氧化) HILIC (游离多聚糖) RP(肽谱分析) Agilent 1260 Infinity lI生物惰性液相色谱系统 Agilent 1290 Infinity II液相色谱系统 Agilent 1290 Infinity II液相色谱系统 Agilent 1290 Infinity II液相色谱系统 色谱柱 Agilent Bio MAb NP5，4.6×250 mm，5 pm PEEK Agilent ZORBAX RRHD 300 SB-C18，2.1×100 mm， 1.8 pm Agilent AdvanceBio 糖谱分析色谱柱，2.1×150 mm，1.8 pm Agilent AdvanceBio 肽谱分色色谱柱，2.1×150 mm， 2.7 pm， 120 A 进样量 1-10 pL 4pL 2pL 2-8pL 样品恒温箱 5°C 5°C 5°℃ 5°℃ 流动相 A)水 B) NaCl (1000 mmol/L) C) NaHzPO (55 mmol/L)D)NazHPO， (50 mmol/L) A) 0.1%FA (含 0.1%TFA) 水溶液B) 0.1% FA (含0.1%TFA) 的80%IPA， 10%ACN， 10%水 A) 50 mmol/L甲酸铵， pH4.5B) ACN A) 0.1%甲酸水溶液B) 0.1%甲酸的乙腈溶液 梯度 mAb1 和 mAb2 时间 (min)%A %B %C %D0.0 30.3 59.6 10.12.0 26.05.0 56.9 12.18.0 21.510.054.9 13.620.0 13.319.0 51.9 15.821.0 30.3 59.6 10.1 mAb3 时间 (min)%A %B %C %D0.0 44.5 0 44.4 11.120.0 27.7 16.2 38.7 17.421.0 44.50 44.4 11.1 0 min 时→20%B2 min 时→20%B 42 min时→35%B 42.5 min 时→80% B 45 min 时→80% B45.1 min时→20% B 0 min 时→25% B 2 min时→30%B 15.5 min 时→37%B 17 min 时→80% B20 min 时80% B 21 min 时-25% B 30 min 时-25%B 0 min时→3%B 30 min 时→40% B33 min 时→90%B 35 min 时→90% B 37 min 时→3%B40 min 时→3%B 柱温 25°℃ 74°℃ 40°℃ 60°℃ 流速 0.75 mL/min 0.4mL/min 15.5-20 min： 0.25 mL/min， 其他时间 0.4 mL/min 0.4 mL/min UV 220/280nm - 一 FLD 一 Ex/Em=285 nm/345nm - 馏分收集模式 基于时间的馏分触发 - - 参数 WCX (C端赖氨酸、N端环化 异构体和脱酰氨基化) RP(氧化) HILIC(游离多聚糖) RP(肽谱分析) Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 离子模式 正离子模式，双 AJS ESI 正离子模式，双 AJS ESI 正离子模式，双AJS ESI 干燥气体温度 - 350°C 150°℃ 325°C 干燥气流速 - 12 L/min 9L/min 13 L/min 鞘气温度 - 350°C 300°℃ 275°C 鞘气流速 - 11 L/min 10 L/min 12L/min 雾化器 一 35 psi 35 psi 35 psi 毛细管电压 4000V 3000 V 4000V 喷嘴电压 - 2000V 500 V 0V 碎裂电压 180V 180V 175V 锥孔电压 65V 65V 65V 参比质量 一 922.009798 922.009798 121.050873，922.009798 采集模式 扩展(10000 m/z)质量数范围 低质量数，高分辨率(4GHz) 扩展动态范围(2GHz) MS质量数范围 800-5000m/z 300-1700m/z 110-1700 m/z 采集速率 1质谱图/秒 2质谱图/秒 8质谱图/秒 自动MS/MS 范围 - - - 50-1700 m/z MS/MS 采集速率 - - 3质谱图/秒 分离峰宽 - - - 窄(约1.3m/z) 母离子/循环 - - - 前10 碰撞能量 一 电荷态 斜率 偏移2 3.1 1 3和>3 3.6 -4.8 MS/MS阈直 一 - 1000 响应值和0.001% 动态排除开启 一 - 重复一次，排除0.1 或 0.2 min 基于母离子丰度的扫描速率 - - 是 靶标 - 25000 响应值/质谱图 使用 MS/MS 累积时间限 - - 是 纯度 - - - 严格性100%，截留率30% 同位素模型 肽 母离子排序 - 先按电荷态，再按丰度进行排序；+2， +3， >+3 结果与讨论 C端赖氨酸截短 由于羧肽酶的活性，重链C端赖氨酸的截短是常见的 PTM。赖氨酸残基的丢失会减少 mAbs 的净正电荷，从而导致电荷异质性。通过阳离子交换色谱 (CEX)可以很好地分离C端赖氨酸异构体(含赖氨酸和不含赖氨酸)。图1A显示了使用Agilent Bio MAb PEEK 色谱柱分析 mAb1获得的电荷异构体图谱的高分离度分离和三个不同的峰。13.11分钟处的峰记为主峰(M)。早洗脱和晚洗脱峰分别称为酸性异构体(A1和A2)和碱性异构体(B1、B2、B3、B4、B5和B6)。图1A的表格列出了主峰、酸性电荷异构体和碱性电荷异构体的峰面积百分比。在通过 LC/MS肽谱分析表征C端赖氨酸截短之前，将电荷异构体峰收集作为单个馏分，并将多次进样的结果进行合并。基于肽谱分析，使用C端赖氨酸截短异构体对 CEX峰进行标注。通过羧肽酶 B(CPB)处理，进一步证实了C端赖氨酸的异质性。由电荷异构体峰的面积百分比计算得到的C 端赖氨酸截短的相对含量为58.28%(表3)。 在基于肽谱分析的C端赖氨酸异构体图谱定量中，对 mAb1 进行了 LC/MS 肽谱分析。图1B所示为 mAb1 的LC/MS肽谱分析结果。 MS/MS 分析确认了修饰和未修饰重链C端赖氨酸截短肽的归属，并鉴定得到其相对含量为 55.30%。 表3所示为传统 CEX 和肽谱分析方法用于C端赖氨酸截短异构体定量的比较。两种方法估算的C端赖氨酸截短的相对含量相当。 图 1A. 使用配备 Agilent Bio Mab， 4.6×250 mm， 5 pm， PEEK 色谱柱的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统得到的 mAb1 的电荷异构体图谱。经 CPB处理(红色)和未经处理(蓝色)的mAb1色谱叠加图 图1B.使用安捷伦肽谱分析(2.1×150 mm， 2.7 pm) 色谱柱对 mAb1 进行的 LC/MS肽普分析 技术 相对含量% C端赖氨酸异构体 CEX 58.28 肽谱分析 55.30 N端环化异构体(HC) CEX 100 肽谱分析 99.87 Asp55 脱酰胺基化 CEX 3.86 肽谱分析 4.79 氧化(M256+M432) RP-LC/MS(亚基) 2.38 肽谱分析 2.33 多聚糖 HILIC 肽谱分析 Man5 10.9 12.43 GO 6.48 8.35 GOF 49.13 50.41 G1F 28.80 24.57 G2F 4.69 4.24 表3.相对(%)定量结果比较(传统方法与肽谱分析方法) N端环化 N端环化由 N端 Glu 或 GIn 重排为焦谷氨酸 (pyro-Glu) 引起。这导致了净正电荷的减少，从而使 mAb 具有更强的酸性。与C端赖氨酸截短一样，可以通过 CEX 观察到此 PTM 引起的电荷异质性。图2A 显示了使用 Agilent Bio MAb PEEK 色谱柱分析 mAb2 获得的电荷异构体的高分离度分离。13.1分钟处的峰记为主峰(M)。早洗脱和晚洗脱峰分别称为酸性异构体(A1和A2)和碱性异构体(B1、B2和B3)。图2A汇总了主峰、酸性电荷异构体和碱性电荷异构体的面积百分比。在通过LC/MS肽谱分析表征N端环化异构体之前，将电荷异构体峰收集作为单个馏分， 并将多次进样的结果进行合并。基于肽谱分析，使用N端环化异构体对 CEX 峰进行标注。由电荷异构体峰的面积百分比计算得到的重链N 端环化的相对含量为100%(表3)。 在基于肽谱分析的重链 N 端环化定量 中，对 mAb2 进行了LC/MS 肽谱分析。图2B所示为 mAb2 的 LC/MS肽谱分析结果。 MS/MS分析证实了重链肽的N端环化，N端环化的重链分子所占的百分比为99.98%。 表3所示为传统 CEX 和肽谱分析方法用于N 端环化定量的比较。两种方法估算的N端环化的相对含量相当。 时间(min) 图 2A. 使用配备 Agilent Bio Mab， 4.6×250 mm， 5 pm， PEEK 色谱柱的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统得到的 mAb2的电荷异构体图谱 采集时间(min) 图2B.使用安捷伦肽谱分析(2.1×150 mm， 2.7 um) 色谱柱对 mAb2 进行的 LC/MS肽普分析 脱酰胺基化 脱酰胺基化是 mAbs 中最常见的 PTM， 并与蛋白质降解途径相关。天冬酰胺 (Asn或N)残基的脱酰氨基化使 Asn 变为酸性异构体天冬氨酸 (Asp或D)和异天冬氨酸 (isoAsp)， 从而导致净正电荷减少。CDR 区域 Asn的脱按胺基化导致酸性电荷异构体。图3A显示了使用 Agilent BioMAb PEEK 色谱柱分析 mAb3获得的电荷异构体图谱的高分离度分分。 11.4分钟处的峰记为主峰(M)。早洗脱和晚洗脱峰 分别称为酸性异构体本(A1和A2)和碱性异构体(B1、B2、B3和B4)。图3A汇总了主峰、酸性电荷异构体和碱性电荷异构体的面积百分比。在通过 LC/MS 肽谱分析表征脱酰胺基化之前，将电荷异构体峰收集作为单个馏分，并将多次进样的结果进行合并。肽谱分析确定了馏分A2中的 Asn55 脱酰胺基化。由电荷异构体峰的面积百分比计算得到到 N55脱酰胺基化的相对含量为3.86%(表3)。 在基于肽谱分析的脱酰胺基化定量中，对mAb3 进行了 LC/MS肽谱分析。图3B所示为 mAb3 的 LC/MS肽谱分析结果。MS/MS分析确认了修饰和未修饰IYPTN55GYTR肽的归属，并鉴定得到Asn55 脱酰胺基化的相对含量为4.79%。表3所示为传统 CEX 和肽谱分析方法用于脱酰胺基化定量的比较。两种方法估算的 Asn55 脱酰胺基化水平的相对含量 相当。 时间 (min) 图 3A. 使用配备 Agilent Bio Mab， 4.6×250 mm， 5 pm， PEEK 色谱柱的 Agilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统得到的 mAb3的电荷异构体图谱 采集时间(min) MS/MS 谱图 IYPTDGYTR 543.2567 1084.5139 脱酰胺基化 4.79% 图3B.使用安捷伦肽谱分析(2.1×150 mm， 2.7 um) 色谱柱对 mAb3 进行的 LC/MS肽谱分析 氧化 蛋氨酸 (Met) 的氧化在 mAbs 中非常常见，该反应会导致蛋白质构象发生变化，从而改变其功能。Fc 区域包含两种蛋氨酸(Met)残基(M256 和 M432)，它们更容易发生氧化。氧化导致质量数增加16Da，这可以在肽段和完整 mAbs 中测量得到。 图4A显示了使用 Agilent ZORBAX RRHD300 SB-C18 柱分离的 Ides 酶解 mAb2 Fc 亚基的 LC/MS 谱图。解卷积质谱图中的主峰对应于两种氧化产物，它们很可能来自M256和M432。使用解卷积质谱图的峰面积计算得到 Fc 氧化的相对含量为2.38%。 在基于肽谱分析的氧化定量中，对mAb2 进行了 LC/MS 肽谱分析。图4B所示为胰蛋白酶 mAb2 肽的 LC/MS谱图。MS/MS分析确认了被氧化和未修饰肽异构体(DTLM256ISR和 WQQGNVFSCSVM432HEALHNHYTQK)的归属，并鉴定得到相对氧化含量(M256+M432) 为 2.33%。 表3所示为使用亚基分析或肽谱分析方法进行氧化定量的比较，两种方法的估算结果相当。 图 4A. 使用 Agilent ZORBAX RRHD 300 SB-C18， 2.1×100 mm， 1.8 pm， PEEK色谱柱对 Ide酶解的 mAb2 进行的LC/MS分析。 Fc 片段的解卷积质谱图显示出 32 Da 的偏移(对应于两次氧的添加) ×107 WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK 7 DTLMISR 6 图4B.使用安捷伦肽谱分析(2.1×150 mm， 2.7 pm) 色谱柱对 mAb2 进行的 LC/MS 肽谱分析. 糖基化 天冬酰胺连接的N-连接糖基化是最重要的PTMs 之一，可导致 mAb 异质性。在生物药物生产过程中，多聚糖的表征至关重要。图5A显示了使用 Agilent AdvanceBio糖谱分析色谱柱从 mAb1 分离 InstantPC标记 N-糖得到的荧光色谱图，所示的主要多聚糖为 GOF、G1F 和 G2F。通过充分分离多聚糖种类计算相对含量，内插表格中列出了各多聚糖的相对定量结果。为确认多聚糖标注，将来自各峰的MS信号与多电荷H*和 Nat加合离子的同位素模型进行匹配。 在基于肽谱分析的多聚糖种类定量中，对mAb1的胰蛋白酶酶解肽段进行了 LC/MS分析。图5B显示了使用AdvanceBio 肽谱分析色谱柱分离的不同糖基化 TKPREEQYNSTYR 肽的叠加提取离子色谱图(EIC)。MS分析鉴定出TKPREEQYNSTYR 肽的主要糖型 (GO、G1F、GOF 和 G2F)， 其中与 GOF 和 G1F对应的糖型丰度最高。 图5C和表3所示为使用游离多聚糖(HILIC) 和肽谱分析方法进行多聚糖定量的比较，两种方法的估算结果相当。所得的相关系数为0.98，表明主要多聚糖的HILIC 和 RP肽谱分析方法之间具有较强的正相关性。 图5A.来自mAb1 的InstantPC 标记多聚糖的荧光色谱图和定量结果 图 5B.各 m/z 的 MS提取化合物色谱图，其比值与糖基化 TKPREEQYNSTYR 殳段和定量结果相称 图 5C.关联图。HILIC 法和肽谱分析方法定量分析多聚糖的结果比较 本研究展示了利用安捷伦肽谱分析工作流程对mAbs 多个 CQAs 的监测。比较肽谱分析与传统分析方法对多个属性的相对(%)定量，显示两种方法之间具有较好的相关性。研究结果表明，肽谱分析方法可以取代传统分析方法用于mAb 质量属性的监测，有效节省分析时间和成本。 ( 参考文献 ) ( 1. R ogers，R. S. et al. A View on theImportance of"Multi-AttributeMethod"for Measuring Purity ofBiopharmaceuticals and ImprovingOverall Control Strategy. The AAPS Journal 2018，20，7 ) 2. 使用高分辨率 LC/MS 对两种利妥昔单抗生物仿制药的完整质量数、亚基质量数和游离多聚糖进行比较研究，安捷伦科技公司应用简报，出版号5994-1653ZHCN，2020 3. ( R apid Antibody Digestion Enabledby Automated Reversed-PhaseDesalting on the Agilent AssayMAP Bravo Platform (通过 AgilentAssayMAP Bravo平台上的自动化 反相脱盐实现快速抗体酶解) ，安捷伦科技公司应用简报，出版号 ) 5991-6478EN， 2016 查找当地的安捷伦客户中心： www.agilent.com/chem/contactus-cn 800-820-3278，400-820-3278(手机用户) LSCA-China_800@agilent.com www.agilent.com/chem/erfq-cn www.agilent.com/en/solutions/biopharma 本文中的信息、说明和指标如有变更，恕不另行通知。 基于多属性方法 (MAM) 的 LC/MS 肽谱分析在生物制药分析领域受到了广泛的关注。本应用展示了使用 LC/MS 肽谱分析方法对不同单克隆抗体 (mAb) 的关键质量属性 (CQAs) 进行的表征和定量分析。将肽谱分析结果与传统方法进行了比较，结果表明，肽谱分析与传统方法对赖氨酸截短、氧化、脱酰氨基化、N 端环化和糖基化程度的估算高度相似。