土壤中磺胺类药物检测方案(液质联用仪)

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宁波农业科技22014年第1期 超高效液相色谱-串联质谱测定土壤中磺胺类药物残留 吕燕1，赵健1，杨挺1，吴银良1，张雪艳? (1.宁波市农业科学研究院 315040；2.通标标准技术服务有限公司青岛分公司 266102) 摘 要：建立了固相萃取-超高效液相色谱串联质谱法测定土壤中18种磺胺类药物残留量的分析方法，土壤样品经乙腈+水+甲酸混合溶液提取后，用 HLB固相萃取小柱富集净化，洗脱液经氮气吹干后用甲醇复溶，进行 LC-MS/MS分析。该方法在10min 内完成对18种磺胺类药物的分析。磺胺类药物的线性范围为1~100p.g/L， 相关系数均大于0.995。18种磺胺类药物的方法检出限在0.05~0.48mg/kg 之间，实际样品的加标回收率在64.9%~104%之间，6次空白加标重复测定的相对标准偏差在1.8%~15.9%之间。该方法操作简便，重现性好，可用于土壤中磺胺类药物物检测分析。 关键词：磺胺类药物；液相色谱串联质谱法；固相萃取；土壤 磺胺类药物(sulfonamides， SAs) 为广谱抑菌药，因其具有抗菌广谱、高效、低毒、价格低廉等特点， 在畜牧、水产等养殖生产中广泛使用11-3。磺胺类药物主要用于预防和治疗细菌性感染疾病，但过量使用有可能在人体内蓄积，蓄积超过一定浓度时对人体有害，并导致病原体产生耐药性。与其它常用抗生素相比，这些药物性质更加稳定，其在动物源性食品中的残留可通过食物链对人体健康构成危害。同时抗生素经动物摄入后大部分以原药和代谢产物的形式随粪尿排出体外，成为新的环境污染物，并以多种途径进人河水、地表水甚至饮用水及土壤中[4-5] SAs 及其代谢物的分析方法主要有高效液相色谱法(HPLC)和液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS) 16-10。 HPLC 的灵敏度较低且无法提供结构信息，一般作为筛选方法； LC-MS/MS灵敏度高，选择性和特异性好，抗干扰能力强，能够对目标化合物含量较低的样品进行很好的定性确认，是目前较为先进和常用的动物源性食品中药物残留检测方法。目前 LC-MS/MS 方法已被广泛应用于环境中抗生素类药物的分析I5l。本文在优化土壤样品前处理条件和色谱分离条件的基础上，建立了固相萃取-超高效液相色谱串联质谱测定土壤中18种磺胺类药物的分析方法，并将该方法应用于实际样品分析，该方法具有操作简单、所需试剂少、分离速度快、灵敏度高、定量准确、线性范围宽等优点。 1材料与方法 1.1 仪器和试剂 Acquity UPLC XevoTM TQ MS超高效液相色谱串联质谱仪(美国 Waters 公司)；固相萃取仪(美国 Supelco公司)；离心机 (Sigma 公司)；超声波清洗器(美国Cole-Parmer公司)； Oasis HLB 固相萃取柱(500mg/6mL， Waters 公司)。甲醇和乙腈为色谱纯，均购自 Fisher Scientific 公司；甲酸(纯度为99%， Acros Organics)； 氨水斤分析纯净；盐酸为优级纯，北京化学试剂公司；实验室用水均为超纯水，电阻率≥l8.2MQ·cm。18种磺胺类药物均购自Dr.Ehrenstorfer 公司 (Augsburg， Germany)，纯度均高高97%. 1.2 标准溶液配制 以甲醇为溶剂，分别配制质量浓度为 1000mg/L的标准储备液，于-18℃保存。临用时用0.1%甲酸溶液稀释上述标准储备液，配制成不同浓度的标准工作液。 1.3 样品采集 土壤样品于2013年3月采自宁波，将不同土壤污泥样品分别风干后，研磨混匀，转移至密闭玻璃瓶中-20℃保存。 1.4 样品前处理 称取 10g样品于50mL离心管中，用乙腈+水+甲酸(49+49+2，v/v/v) 混合溶液 20mL 超声提取10min，再振荡10min， 4℃离心 10min ( 9500r/ min)， 将上清液转入50mL容量瓶中，重复上述步骤，合并提取液，定容。移取25mL提取液在氮吹条件下35℃水浴吹至15mL左右，过已经6mL甲醇和6mL水活化的 HLB小柱，待上述提取液经过HLB 小柱后，再用5mL水淋洗，真空抽干10min后，用10mL甲醇洗脱， 洗脱液在氮吹条件下35℃ 水浴吹干， 1mL甲醇定容，过 0.22um滤膜， 进行LC-MS/MS分析。 1.5LC-MS/MS测定条件 色谱柱： Acquity UPLC CSH C18 2.1mmx100mm，1.7u.m；进样量： 5pL；柱温：30℃；梯度洗脱条件详见表1： 表1梯度洗脱条件 时间 (min) 流速 (mI/min) 0.1%甲酸溶液 (10mmol/L乙酸铵) (%) 甲醇(%) 0.0 0.3 90 10 1.0 0.3 90 10 2.5 0.3 80 20 8.0 0.3 60 40 8.1 0.3 20 80 9.2 0.3 20 80 9.5 0.3 90 10 10.0 0.3 90 10 源温：150℃；雾化温度：500℃；离子源：电 1000L/h；各物合物的定性子离子、定量子离子、喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；监测方式： 去簇电压和碰撞能详见表2。 多反应监测；电喷雾电压：2.0KV；雾化气： 表2定性子离子、定量子离子、锥孔电压和碰撞能量 化合物 母离子 定性子离子 (m/z) 定量子离子(m/z) 锥孔电压(V) 碰撞能量(V) 保留时间 (min) 磺胺醋酰 215.16 107.97，155.94 155.94 18 20，10 2.33 磺胺吡啶 250.16 107.97，156.02 156.02 34 24，16 3.58 磺胺嘧啶 251.16 107.97，155.96 155.96 28 20，14 3.03 磺胺甲噁唑 254.16 107.97，155.94 155.94 28 22，16 5.92 磺胺噻唑 256.13 107.97，155.95 155.95 28 24， 14 3.53 磺胺甲基嘧啶 265.22 155.95，172.02 155.95 30 16，14 3.83 磺胺恶唑 268.16 112.92，155.95 155.95 30 18，16 4.58 磺胺二甲异恶唑 268.22 113.05，155.95 155.95 30 18，16 6.52 磺胺甲噻二唑 271.16 107.97，155.95 155.95 26 20， 14 4.99 磺胺苯甲酰 277.29 107.96， 155.95 155.95 18 20，12 7.19 磺胺二甲嘧啶 279.22 156.00，186.03 186.03 18 14，18 4.78 磺胺甲氧哒嗪 281.16 126.00，155.95 155.95 30 20，18 5.18 磺胺间甲氧嘧啶 281.16 126.00，155.95 155.95 30 20，18 5.83 磺胺氯哒嗪 285.10 107.90，155.89 155.89 22 24，14 5.68 磺胺喹恶啉 301.22 107.97，155.94 155.94 34 22， 14 8.63 磺胺邻二甲氧密啶 311.22 107.97，156.02 156.02 38 28，20 6.31 磺胺间二甲氧嘧啶 311.22 107.97，156.02 156.02 38 28，20 8.60 磺胺苯吡唑 315.22 155.94，158.09 155.94 40 20，32 7.92 2 结果与讨论 2.1前处理条件优化 由于磺胺类药物在土壤表面的吸附机理包含离子键作用和氢键作用，故提取液中加人甲酸，更有利于破坏氢键，利于药物与污泥解离，因此，在酸性条件下的提取效果更好。于是本文采用甲酸水溶液加人适量有机溶剂作为提取液提取土壤样品中的磺胺类药物。考虑到混合溶液中使用甲醇时提取的杂质较多，且乙腈具有更好的去除蛋白效果，因此本实验选择乙腈+水+甲酸作为提取溶液。在此基础上考察了乙腈+水+甲酸(24/74/2， v/v/v)、乙腈+水+甲酸(49/49/2， v/v/v) 和乙+水+甲酸(74/24/2， v/v/v)三种提取液对提取效果的影响，结果显示只有当使用乙腈+水+甲酸 (49/49/2， v/v/v)和乙乙+水+甲酸(74/24/2， v/v/v)提取时，磺胺类药物的回收率在60%~126%之间，能满足分析要求；考虑到环境安全问题，本实验选择含有机溶剂相对较少的乙腈+水+甲酸(49/49/2， v/v/v)作为提取剂。同时经研究表明，相比单独采用超声或振荡提取，超声和振荡同时进行时提取效果更好，提取回收率能达到 62%~116%。 2.2 固相萃取条件优化 土壤中的天然有机质(如腐殖酸等)含量较高，在液相色谱串联质谱分析过程中，会产生基质抑制，造成被测化合物的灵敏度降低。因此，本文采取固相萃取技术对提取液中的日标药物进行富集净化。通常影响固相萃取富集效率的因素有固相萃取小柱类型、样品pH值及上样速度等，本实验采用空白加标对上述因素进行优化。经HLB柱、MAX柱、MCX柱、C18柱、活性碳及纳米管等的富集效果比较，磺胺类药物经过 HLB 柱后的绝对回收率均高于66%，而其它净化方式均有组分回收率偏低，因此，本实验选用HLB 柱对污泥样品进行富集净化。 2.3 方法线性范围和检出限 将标准储备液 (1000mg/L) 用0.1%甲酸溶液稀释配制成浓度为1，5，10，20，50和100pg/L的标准工作液，进行LC-MS/MS分析测定。以定量离子对的峰面积(Y)和对应浓度 (X， ug/L) 进行线性回归，得到标准曲线，其线性方程和相关系数等详见表3。以最低添加浓度 (1.0p.g/kg) 样品计算信噪比，并以3倍信噪比 (S/N)估算出方法检出限，18种磺胺类药物的检出限在0.05~0.48p.g/kg 之间，详见表4，相关色谱图详见图1。与已有的文献相比，本方法的检出限处于较低或相当的水平16-101 序号 组分 回归方程 线性范围(pg/L) 相关系数 (r) 磺胺醋酰 Y=96.59X-38.23 1~100 0.9989 2 磺胺吡啶 Y=106.1X+63.34 1~100 0.9992 3 磺胺嘧啶 Y=64.54X+8.703 1~100 0.9983 4 磺胺甲噁唑 Y=82.17X+11.45 1~100 0.9956 5 磺胺噻唑 Y=209.2X+60.58 1~100 0.9997 6 磺胺甲基嘧啶 Y=77.87X+36.45 1~100 0.9971 7 磺胺恶唑 Y=93.71X+57.05 1~100 0.9990 8 磺胺二甲异恶唑 Y=152.8X+51.23 1~100 0.9991 9 磺胺甲噻二唑 Y=589.4X-104.7 1~100 0.9973 10 磺胺苯甲酰 Y=873.8X+26.27 1~100 0.9998 11 磺胺二甲嘧啶 Y=336.9X+43.79 1~100 0.9986 12 磺胺甲氧哒嗪 Y=159.5X+22.18 1~100 0.9997 13 磺胺间甲氧嘧啶 Y=87.57X+22.82 1~100 0.9977 14 磺胺氯哒嗪 Y=472.8X+183.0 1~100 0.9993 15 磺胺喹恶啉 Y=93.59X+320.3 1~100 0.9969 16 磺胺邻二甲氧嘧啶 Y=156.4X+107.8 1~100 0.9996 17 磺胺间二甲氧嘧啶 Y=170.9X-7.316 1~100 0.9990 18 磺胺苯吡啶 Y=630.1X+528.6 1~100 0.9957 图1代表性磺生类药物标准溶液 (20130627014)、土壤空白样品(20130627012)、土壤添加样品(20130627013) MRM 色谱图 2.4 方法准确度和精密度试验 本实验进行了1pg/kg、5pg/kg、10pg/kg 三个浓度的污泥加标回收试验，每个浓度平行测定6次，结果见表4。由表可见目标化合物的平均回收 率为64.9%~104.0%，批内相对标准偏差(RSD)为 1.8%~15.9%，这些数据说明，该方法具有较好的准确性和重现性。 1pg/kg 5pg/kg 10pg/kg检出限/(ug/kg) 平均回收率(%) RSD (%) 平均回收率(%) RSD (%) 平均回收率(%) RSD (%) 磺胺醋酰 79.1 14.3 83.3 11.5 84.3 10.3 0.30 磺胺吡啶 82.8 88.9 95.3 8.3 0.45 磺胺嘧啶 86.8 96.9 92.3 12.0 0.32 磺胺甲噁唑 75.8 10.5 87.3 12.7 90.0 0.28 磺胺噻唑 76.3 3.8 87.7 8.2 104.0 0.48 磺胺甲基嘧啶 87.6 9.0 80.4 15.8 102.0 11.2 0.35 磺胺恶唑 75.6 78.3 11.1 84.3 0.35 磺胺二甲异恶唑 69.5 75.6 87.0 0.05 磺胺甲噻二唑 72.1 103.0 95.5 0.35 磺胺苯甲酰 64.9 81.7 92.4 0.20 磺胺二甲嘧啶 75.2 80.6 82.0 0.30 磺胺甲氧哒嗪 73.7 10.8 82.6 11.5 93.6 0.09 磺胺间甲氧嘧啶 82.6 6.3 87.5 92.4 1.8 0.25 磺胺氯哒嗪 81.9 15.4 84.4 85.2 0.25 磺胺喹恶啉 77.8 88.3 89.2 0.08 磺胺邻二甲氧嘧啶 73.4 87.3 11.4 93.5 0.08 磺胺间二甲氧嘧啶 70.1 75.3 9.8 75.8 0.06 磺胺苯吡啶 75.8 13.12 83.7 15.9 80.5 11.3 0.20 2.5 方法应用 应用本方法对宁波某沼泽池采集的30多个污泥样品进行检测分析，发现共有3个样品检出磺胺间甲氧嘧啶，由此可见，本方法还是实用可行的。 3 结论 本文建立了土壤中18种磺胺类抗生素药物的超高效液相色谱串联质谱测定分析方法。该方法能在 10min 内完成对18种按胺类药物的分析。18种磺胺类药物的方法检出限在0.05~0.48pg/kg之间，实际样品的加标回收率在 64.9%~104.0%之间，6次空白加标重复测定的相对标准偏差在1.8%~15.9%之间。该方法操作简便，重现性好，可用于土壤中磺胺类药物的检测分析. 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