地氯雷他定口服液中洋葱伯克霍尔德菌检测方案(生物质谱)

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快速有效地鉴定口服溶液中致病菌——Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统 1引言 近些年，洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia) 引起医用产品污染，进而导致患者严重感染的事件，被越来越多的制药企业和药监管理系统所重视。2019年12月1日，FDA 已在药典中新增一章《非无菌药品的检查——洋葱伯克霍尔德菌的检验》，并予以正式实施。我国在《中国药典》2020年版中也将新增洋葱伯克霍尔德菌的检查指标。 洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia ) 是一种条件致病菌，可引发包括肺炎、败血症、心内膜炎、伤口感染、脓肿在内的多种感染，死亡率高达95%。它最厉害的地方在于，它可形成生物膜，对消毒剂的抵抗力较强，在恶劣条件下也能生存，并对多种抗生素有很高的耐受性，一旦得上，治疗就不太容易。因此在源头上对药品等医用产品进行严格把关就显得至关重要。 2实验部分 2.1主要设备与试剂 设备： Ebio ReaderTM 3700M 飞行时间质谱系统，高速离心机 试剂：α-氰-4-羟基肉桂酸(CHCA)乙腈、三氟乙酸、甲酸、乙醇、纯水 2.2样品处理及仪器分析 2.2.1菌种培养 菌悬液制备： 在生物安全沐内，将洋葱伯克霍尔德氏菌冻干粉溶于胰酪大豆胨液体培养基中，在32℃的电热恒温培养箱中培养，备用。 待检样品制备： a)菌种阳性对照：在生物安全柜内，将洋葱伯克霍尔德氏菌冻干粉溶于胰酪大豆胨液体培养基中，在32℃的电热恒温培养箱中培养，备用。 b)地氯雷他定口服溶液：取三个批次地氯雷他定口服溶液溶于胰酪大豆胨液体培养基中，置32℃电热恒温培养箱中培养； c)地氯雷他定口服溶液+菌种培养：取三个批次地氯雷他定口服溶液和已制备的菌悬悬溶于胰酪大豆胨液体培养基中，置32℃电热恒温培养箱中培养； d)纯化水：取纯化水溶于胰酪大豆胨液体培养基中，置32℃电热恒温培养箱中培养，同法制备2份； e)纯化水+菌种培养：取纯化水和已制备的菌悬液溶于胰酪大豆胨液体培养基中，置32℃电热恒温培养箱中培养，同法制备2份。 2.2.2蛋白提取方法 量取适量的待测样品，以5000r/min 离心5 min 收集沉淀物，加入300pl纯净水，混匀，再加入900 ul 无水乙醇，混匀后以12000r/min 离心2min ， 弃去上清液，待管中残留液体彻底干燥后，加入50pl70%甲酸混匀，再加入50pl乙川混匀，以12000r/min离心2min，吸取上清液。 2.2.3点样及仪器分析 移取经上述方法处理后的上清液，与等体积的基质溶液(CHCA)混合，然后涂布于96孔样品板上，自然晾干后上仪器分析。 质谱仪器参数如下：正离子模式，检测范围：2000Da~15000 Da；激光点击数：每图谱200；激光频率：20Hz；离子源加速电压：20kV。每次实验前用校准品对仪器进行质量轴校正。 3实验结果 样品处理后经 Ebio ReaderTM 3700M飞行时间质谱系统分析获得质谱图见下图。洋葱伯克霍尔德氏菌的质谱图1、纯水的质谱图2、纯水+菌的质谱图3、三个批次地氯雷他定口服溶液的质谱图4、三个批次的地氯雷他定口服溶液+菌的质谱图5。从图2和图3对比可知，本批次纯水样品中不含洋葱伯克霍尔德氏菌，纯水+菌的样品中能鉴别出洋羊伯克霍尔德氏菌。从图4和图5对比可知，三个批次地氯雷他定口服溶液中不含洋葱伯克霍尔德氏菌，三个批次的地氯雷他定口服溶液+菌中能鉴别出洋葱伯克霍尔德氏菌。从口服溶液和纯水样品间对比结果可知， Ebio ReaderTM 3700M 飞行时间质谱系统鉴定结果与实验方案预期效果一致，能准确有效地鉴别口服溶液或纯水中是否含有洋洋伯克霍尔德氏菌。 图1：Ebio ReaderTM 3700M 分析洋葱伯克霍尔德氏菌的质谱图 图2： Ebio ReaderTM 3700M 分析纯水的质谱图 图3： Ebio ReaderTM 3700M分析纯水+菌的质谱图 图4： Ebio ReaderTM 3700M分析三个批次地氯雷他定口服溶液的质谱图 m 图5： Ebio ReaderTM 3700M分析三个批次的地氯雷他定口服溶液+菌的质谱图 4小结 MALDI-TOF-MS 是应用于细菌快速检测的一种新技术，与传统检测技术以及目前常用的全自动细菌鉴定方法相比，具有鉴定速度快、通量高、结果准确，成本低等优势。 本实验结果证明，东西分析研发生产的 Ebio ReaderTM 3700M 飞行时间质谱系统可准确且快速有效的鉴别药品中是否存在洋葱伯克霍尔德氏菌群，为药品的安全生产提供质量把关。 近些年，洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）引起医用产品污染，进而导致患者严重感染的事件，被越来越多的制药企业和药监管理系统所重视。2019年12月1日，FDA已在药典中新增一章《非无菌药品的检查——洋葱伯克霍尔德菌的检验》，并予以正式实施。我国在《中国药典》2020年版中也将新增洋葱伯克霍尔德菌的检查指标。洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）是一种条件致病菌，可引发包括肺炎、败血症、心内膜炎、伤口感染、脓肿在内的多种感染，死亡率高达95%。它最厉害的地方在于，它可形成生物膜，对消毒剂的抵抗力较强，在恶劣条件下也能生存，并对多种抗生素有很高的耐受性，一旦得上，治疗就不太容易。因此在源头上对药品等医用产品进行严格把关就显得至关重要。