橄榄油中维生素 E检测方案(超临界色谱)

智能文字提取功能测试中

使用 Agilent 1260 Infinity 分析型SFC 系统测定橄榄油中的维生素E 快速、高分离度分离生育酚和生育三烯酚的所有异构体 应用简报 食品检测与农业 作者 摘要 Edgar Naegele 安捷伦科技有限公司 Waldbronn， Germany 本应用简报介绍了使用 Agilent 1260 Infinity 分析型超临界流体色谱 (SFC)系统通过 SFC分离八种生育酚和生育三烯酚化合物。生成所有化合物的校准曲线，并对实际初榨橄榄油样品进行分析。测定了检测限和定量限 (LOD和LOQ) 以及保留时间和峰面积的相对标准偏差 (RSD)。 Agilent Technologies 超临界流体色谱 (SFC) 是一种通用的工具，能够替代目前为止首选正相液相色谱(LC)系统所实现的分离。 SFC的优势在于，与正相LC相比，其分离速度快得多，且精密度更高。此外， SFC 无需使用有害溶剂。 脂溶性维生素是能够通过 SFC 进行分离的一类典型化合物。这类化合物包括维生素E系列。生育酚及其不饱和相关化合物生育三烯酚属于这个系列，它们具有各种异构体形式，包括a、β、y、6-生育酚和生育三烯酚。这些化合物具有高生物活性和抗氧化剂潜力，并且是对人类健康有益的营养物质。维生素E 及其他健康物质的天然来源之一是由橄榄树(Oleaeuropea L.) 的果实获得的初榨橄榄油12。通常，橄榄油中约95%的维生素E是a-生育酚。对生产橄榄油的国家/地区而言，橄榄油是具有重要经济价值的商品，因此人们开发出各种橄榄油分析方法以确保其真实性和质量。 本应用简报介绍了利用 SFC 分析橄榄油中的维生素E化合物，相比于广泛使用的正相LC， SFC 的分析时间更短且精密度更高。 实验部分 色谱柱 仪器 ( Agilent ZORBAX NH2，4.6×150 mm， 5 pm(部件号883952-708) ) 所有实验均采用 Agilent 1260 Infinity分析型 SFC 系统 (G4309A)， 该系统包括以下模块： ( 软件 ) ( Agilent 1260 Infinity SFC 控制 模块 ) ( Agilent OpenLAB CDS ChemStation 版， 适 用于 LC 和 LC/MS系统，修订 版 C.01.06 ) Agilent 1260 Infinity SFC 二元泵 标准品 ( Agilent 1260 Infin i ty 高性能脱气机 ) ( 生育酚和生育三烯酚混合溶液标准品 (溶于己烷)购 自 LGC Standards (Teddington， UK)。 ) ( Agilent 1260 Infinity SFC 标准 自动进样器 ) ( 样 品 ) ( Agilent 1260 Infinity 二极管阵列检测器(DAD)，配备高压 SFC 流通池 ) ( 天然橄榄油购自当地超市。用己烷将 橄榄油稀释至100 mg/mL， 直接用于 分析。 ) ( Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (TCC) ) 化学品 所有溶剂均购自德国 Merck 公司。新制超纯水产自配置 LC-Pak Polisher和0.22 pm 膜式终端过滤器(Millipak)的 Milli-Q Integral 水纯化系统。 SFC 方法 参数 值 溶剂A CO2 改性剂B 乙醇 SFC 流速 4.5 mL/min 梯度 0分钟时3%B，6分钟时增加至4.5%B 停止时间 6分钟 后运行时间 2分钟 BPR 压力 210 bar BPR温度 60°℃ 柱温 50°℃ 进样量 5pL， 定量环过量填充3倍，用己烷在样品瓶中清洗进样针 DAD (紫外-可见) 波长295nm， 带宽4nm 参比550nm， 带宽100 nm 狭缝8 nm 数据采集速率10 Hz 利用氨基固定相色谱柱和 4.5 mL/min的流速分离四种生育酚异构体和四种生育三烯酚异构体化合物。所用梯度的有机相组成接近等度行为，乙醇含量仅从3%增加至4.5%。该梯度能够分离早洗脱化合物，并缩短后洗脱化合物的保留时间，从而得到更尖锐的峰。优化的反压 210 bar 和较高的50°℃柱温还有助于提高后洗脱化合物的分离度。图1显示了在6分钟的分析时间内分离标准储备液中生育酚和生育三烯酚化合物得到的色谱图。 为校准所有化合物，使用1：2的稀释模式将储备液(浓度1)稀释得到六种浓度(表1)。 由浓度5的稀释液所获得的峰表明信噪比(S/N)约为10， 将该浓度用作校准曲线的最低浓度并计算定量限(LOQ)。利用浓度6下测得的峰计算检测限(LOD)， 取 S/N 比为 3。 LOQ 通常小于 23 pg/mL， LOD 小于 7 pg/mL(表2)。 图 1.利用 SFC 分离a、β、y、6-生育酚和a、β、y、6-生育三烯酚的混合物 表1.使用1：2 的稀释模式所得到的各种化合物的校准浓度 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4 浓度5 浓度6 (ug/mL) (ug/mL) (pg/mL) (ug/mL) (ug/mL) (ug/mL) a-生育酚 463.00 231.50 115.75 57.88 38.94 14.46 α-生育三烯酚 447.00 223.15 111.75 55.88 27.94 13.96 β-生育酚 203.00 101.50 50.75 25.34 12.69 4.23 y-生育酚 430.00 215.00 107.50 53.75 26.88 13.44 β-生育三烯酚 135.00 67.50 22.50 11.25 5.65 2.81 y-生育三烯酚 467.00 233.50 116.75 58.37 29.18 14.59 6-生育酚 423.00 211.50 105.75 52.88 26.44 13.22 6-生育三烯酚 414.00 207.00 103.50 51.75 25.88 12.94 表2.各种生育酚和生育三烯酚的保留时间和峰面积相对标准偏差以及 LOQ、LOD和线性 保留时间 峰面积 LOQ LOD 保留时间 RSD RSD (ug/mL) (ug/mL) R² a-生育酚 1.799 0.24 5.75 18.11 5.43 0.9997 a-生育三烯酚 2.124 0.31 4.89 22.88 6.87 0.9991 β-生育酚 3.273 0.23 5.59 14.58 4.38 0.9999 y-生育酚 3.624 0.27 6.45 22.03 6.62 0.9998 β-生育三烯酚 3.884 0.23 6.27 14.79 4.44 0.9992 y-生育三烯酚 4.240 0.16 5.04 35.58 10.68 0.9991 6-生育酚 4.517 0.14 6.62 27.54 8.27 0.9998 6-生育三烯酚 5.302 0.14 5.58 27.53 8.27 0.9999 图2显示了在浓度1至浓度5下获得的所有化合物的峰的叠加图。所有校准的线性均处于良好范围，R²优于0.999。在统计评估中，将按照1：10的比例稀释的储备液进样分析10次，并计算保留时间和峰面积的相对标准偏差(RSD)。保留时间的 RSD 通常优于0.3%，且峰面积的 RSD 优于6%(表2)。较高的峰面积 RSD 值可以解释为，生育酚和生育三烯酚在液相色谱系统的不锈钢毛细管上发生了降解或吸附。 最后，对特级初榨橄榄油样品进行测量以测定维生素E化合物的含量。用己烷稀释橄榄油并直接进样分析。色谱图显示，仅1.79分钟处的a-生育酚为可定量的主峰，而3.6分钟处存在极小的y-生育酚的峰(图3)。所测量的橄榄油中a-生育酚的最终浓度为184.8 mg/kg。 结论 本应用简报介绍了使用 Agilent 1260Infinity 分析型 SFC 系统对橄榄油中维生素E化合物(如生育酚和生育三烯酚)的定量分析。结果表明，四种生育酚异构体和四种生育三烯酚异构体在6分钟的分析时间内完成了分离，比常用的正相 LC 方法快大约5倍。另一方面，正相分离中所用的有机溶剂为有害溶剂，相比之下， SFC 分离中使用的是乙醇改性剂。获得的LOQ 通常小于 23 ug/mL， LOD 小于7 g/mL， 且R²优于0.999。 图2.用于生成 a、β、y、6-生育酚和 a、β、y、6-生育三烯酚的校准曲线的各校准浓度下的叠加谱图。(有关化合物名称，请参见图1；有关化合物浓度，请参见表1。) 图3.特级初榨橄榄油样品的测量以及a-生育酚的浓度测定 ( 参考文献 ) 1. Owen； et al. Phenolic compoundsand squalene in olive oils： Theconcentration and antioxidantpotential of total phenols，simplephenols，secoiridoids，lignansand squalene，Food and ChemicalToxicology 2000， 38， pp 647-659 2. Cunha； et al. Quantification ofTocopherols and Tocotrienols inPortuguese olive oils using HPLCwith three different detectionsystems， Journal of Agriculturaland Food Chemistry 2006， 54， pp3351-3356 ( 3. Aparicio，R； Aparicio-Ruiz， R . Authentication of v egetable oilsby chromatographic techniques，Journal of Chromatography A 2000，881， pp 93-104 ) ( 4. Cort； et al. Stability of Alpha - and Gamma-Tocopherol： Feand Cu*Interactions， Journal of Food Science 1978，43， pp 797-798 ) www.aqilent.com ( 本文中的信息、说明和指标如有变更， 恕不另行通知。 ) ( ◎安捷伦科技(中国)有限公司，2017 ) ( 2017年10月15日，中国出版 ) 5991-5499ZHCN 本应用介绍了使用 Agilent 1260 Infinity 分析型 SFC 系统对橄榄油中维生素 E 化合物（如生育酚和生育三烯酚）的定量分析。结果表明，四种生育酚异构体和四种生育三烯酚异构体在 6 分钟的分析时间内完成了分离，比常用的正相 LC 方法快大约 5 倍。另一方面，正相分离中所用的有机溶剂为有害溶剂，相比之下，SFC 分离中使用的是乙醇改性剂。获得的LOQ 通常小于 23 µg/mL，LOD 小于7 µg/mL，且 R2 优于 0.999。