不同类别药物中分离检测方案(超临界色谱)

智能文字提取功能测试中

使用超临界流体色谱与三重四极杆质谱定量测定药物 应用简报 法医毒理学 作者 摘要 Edgar Naegele 安捷伦科技有限公司 Waldbronn， Germany 本应用简报介绍了使用 Agilent 1260 Infinity 分析型 SFC 系统与三重四极杆质谱仪相结合，快速分离25种药物并实现检测限低至 30 pg/mL 的定量分析。对于所有化合物，校准曲线均表现出优异的线性相关性。对重复测量的统计评估表明，所有25种化合物均具有最高的精度和准确度。最后，介绍了对尿液样品中安非他明类化合物的测定。 4.44.6 Agilent Technologies 前言 在法医毒理学的多个应用领域中，对多个法医学目标化合物进行了筛查和定量分析。这些领域包括兴奋剂检测、尸检法医毒理学、药物检测甚至爆炸残留物的测定等等。 药物类别本身在化学性质方面也是多种多样的，这对于分离和检测来说非常重要。化学结构的范围从简单的芳香胺和多环芳香苯二氮卓类到复杂的类吗啡结构，甚至包括四氢大麻酚(THC) 等疏水化合物。到目前为止，用于一览式定量筛查所有化合物类别的挑战性分离是通过反相 HPLC/MS完成的。 本应用简报介绍了利用超临界流体色谱 (SFC) 在一次定量筛查运行中对不同类别药物的分离。利用 SFC 进行定量筛查可以在几分钟的较短运行时间内完成，与三重四极杆质谱相结合可获得最高的灵敏度。本应用简报中所用的测试集包括安非他明类、苯二氮卓类、吗啡、吗啡类似物和 THC 等 25种化合物。在绘制校准曲线并进行统计评估后，对加标生物样品进行分析，重点关注安非他明类化合物。在本研究中，对以下目标化合物进行了筛查： 安非他明 -一种中枢神经系统兴奋剂，用途包括被大学生滥用作考试辅助手段²，因为它具有提高成绩的作用3.4.5。然而，较大剂量的安非他明可能会产生严重的副作用，并可能损害认知功能并导致肌肉快速分解° 甲基苯丙胺一也是一种中枢神经兴奋剂。滥用(尤其是吸食透明晶体冰毒)可能导致强烈的副作用，如精神病、偏执、幻觉、横纹肌溶解和脑出血' 安非他明衍生物物3，4-亚甲二氧基苯丙胺(MDA)、3，4-亚甲二氧基-甲基苯丙胺 (MDMA) 和3，4-亚甲二氧基-N-乙基苯丙胺(MDEA) 属于安非他明衍生化 合物。，它们属于精神药物。从药理学上讲，它们可用作血清素、去甲肾上腺素和多巴胺释放药物 图1给出了化学式。相关化学和毒理学信息可公开获取。 实验部分 CH， CH. NH. CH. 安非他明 甲基苯丙胺 HN 3，4-亚甲二氧基苯丙胺 (MDA) 3，4-亚甲二氧基-甲基苯丙胺(MDMA) ( 3，4-亚甲二氧基-N-乙基苯丙胺 (MDEA) ) ( 图1.本研究中使用的安非他明类化合物的化 学结构 ) 仪器 ( Agilent 1260 Infinity 分析型 SFC 系统 (G4309A)： ) ( Agilent 1260 Infinity SFC控制 模块 ) ( Agilent 1260 Infinity SFC 二元泵 ) ( Agilent 1260 Infinity 高性能脱 气机 ) ( Agilent 1260 Infinity SFC 标准自动进样器 ) ( Agilent 1260 Infinity 柱温箱 ) Agilent 1260 Infinity 二极管阵列检测器，配备高压 SFC 流通池 ( 采用安捷伦喷射流技术的Agilent 6460三重四极杆液质 联用系统(G6460C) ) Agilent 1260 Infinity 等度泵(G1310B) 安捷伦分流器套装(G4309-68715) 仪器设置 Agilent 1260 Infinity 分析型 SFC系统与 Agilent 6460 三重四极杆液质联用系统的推荐配置在之前的研究中已有描述。 色谱柱 Agilent ZORBAX SB-C8， 4.6×100 mm，1.8um(部件号828975-906) 软件 适用于三重四极杆质谱仪的Agilent MassHunter 数据采集软件，07.01版 ( Agilent MassHunter 定性分析软件，07.00版 ) ( Agilent MassHunter 定量分析 软件，07.00版 ) ( Agilent MassHunter MRM 和 Source Optimizer软件， 07.00版 ) 通过分流和补偿流将 SFC 连接至 MS： 补偿流组成：甲醇/水(95/5)+0.2%甲酸 补偿尝流速：0.3mL/min 标准品 利用安捷伦 LC/MS 法医毒理学测试混标作为标准储备液。该混合物含浓度为1.00 pg/mL 的 25种化合物，均 以甲醇为溶剂。用甲醇按 1：10 的比例稀释得到用于生成校准曲线的储备液(100 ng/mL)。 化学品 所有化学品均购自 Sigma-Aldrich(Taufkirchen， Germany)。所有溶剂均为 LC/MS级。甲醇购自德国J.T.Baker 公司。新制超纯水产自配置LC-Pak Polisher 和 0.22 pm膜式终端过滤器(Millipak) 的 Milli-Q Integral水纯化系统。 样品前处理 向尿液样品中加入安捷伦LC/MS毒理学测试混标 (100 ng/mL)中固有的全套化合物，用甲醇按1：5的比例进行稀释，涡旋混合，然后在14000 g 下离心5分钟。对上清液进行过滤，并将滤液直接进样分析。 SFC 方法 参数 描述 SFC 流速 2 mL/min SFC梯度 0分钟-2%B，5分钟-25%B 停止时间 5分钟 后运行时间 2分钟 改性剂 甲醇+0.2%甲酸(FA)+10 mmol/L甲酸铵 BPR温度 60°C BPR 压力 200 bar 柱温 60°℃ 进样量 1pL，定量环过量填充3倍 质谱方法 参数 描述 电离模式 正离子 毛细管电压 3000 V 喷嘴电压 500V 气体流速 8 L/min 气体温度 220°℃ 鞘气流速 12 L/min 鞘气温度 380°C 雾化器压力 25 psi MRM 条件 见表1，其中显示了母离子、碎片离子、碎裂电压和碰撞能量详细信息。系统在动态 MRM模式下运行以确保获得最佳灵敏度 结果与讨论 使用100 ng/mL 的稀释液开发25种药物的色谱分离方法。该溶液还用于通过 MRM Optimizer 软件和 SourceOptimizer 软件对补偿流、安捷伦喷射流和质谱条件进行优化。 最终 SFC 方法采用2%-25%甲醇(含甲酸和甲酸铵)的梯度，在5分钟的运行时间内对25种化合物进行分离(图2)。从色谱柱上洗脱下来的第一种化合物是0.99分钟洗脱的 THC，最后一种洗脱的化合物是4.05分钟洗脱的士的宁。表现出最高强度的化合物是2.95分钟洗脱的美沙酮。 利用100 ng/mL溶液，并用甲醇按1：5：2的稀释模式进行稀释，为固有化合物绘制单独的校准曲线。对所有化合物测量的稀释系列样品的浓度低至0.01 ng/mL， 用于确定各种化合物的定量限(LOQ)和检测限(LOD)。该方法对检测的化合物表现出极高的灵敏度， LOQ低于100 pg/mL， LOD 低于30 pg/mL， 且所有化合物均具有良好的线性相关性(表2)。为进行统计评估，将10 ng/mL 的校准溶液进样分析15次。计算得出的保留时间相对标准偏差 (RSD) 通常低于0.3%，峰面积RSD 处于低于4%的良好范围内。计算得出的浓度精度低于3.5%，对应的浓度准确度介于95%和105%之间。 表1.MRM条件：母离子、碎片离子、碎裂电压和碰撞能量(按保留时间排序，见表2)。由MRM方法得到最终 DMRM 方法 化合物 母离子 碎裂电压(V) 定量离子 CE 定性离子 CE THC 315.2 150 193.2 20 123.3 30 替马西泮 301.1 117 255.1 29 177 45 氯硝西泮 316.1 110 270 24 214 40 地西泮 285.1 169 193 45 154 25 劳拉西泮 321 102 275 21 194 49 硝西泮 282.1 148 236.1 25 180 41 普罗地芬 354.2 153 167 29 91.1 45 奥沙西泮 287 150 269 12 241 20 可卡因 304.2 138 182.1 17 77 61 维拉帕米 455.3 158 165 37 150 45 曲唑酮 372.2 159 176 25 148 37 羟考酮 316.2 143 298.1 17 256.1 25 哌替啶 248.2 128 220.1 21 174.1 17 MDEA 208.1 107 163 9 105 25 海洛因 370.2 149 268.1 37 165 61 PCP 244.1 86 91 41 86.1 9 安非他明 136.1 66 119.1 5 91 17 MDA 180.1 61 163 5 105 21 甲基苯丙胺 150.1 92 119 5 91 17 MDMA 194.1 97 163 9 105 25 美沙酮 310.2 112 265.1 9 105 29 阿普唑仑 309.1 179 281 25 205 49 可待因 300.2 158 165.1 45 58.1 29 氢可酮 300.2 159 199 29 128 65 士的宁 335.2 195 184 41 156 53 缩写：四氢大麻酚(THC)， 3，4-亚甲二氧基-N-乙基苯丙胺 (MDEA)，苯环己哌啶(PCP)，3，4-亚甲二氧基苯丙胺(MDA)，3，4-亚甲二氧基-甲基苯丙胺(MDMA) 表2.25种药物的保留时间、保留时间 RSD 和峰面积 RSD 以及 10 ng/mL 下的浓度精度和准确度。 LOD 和 LOQ， 各种化合物在 100 ng/mL 至LOQ 浓度范围内的校准曲线的线性 化合物 RT RT RSD (%) 峰面积 RSD (%) LOD (pg/mL) )LLOQ (pg/mL) )线性相关系数R’ 浓度精度(%) 江浓度准确度(%) THC 0.997 0.44 4.34 60 200 0.9994 3.78 101.7 替马西泮 1.498 0.44 2.59 40 130 0.9951 2.42 105.5 氯硝西泮 1.642 0.39 2.66 100 300 0.9982 4.25 102.4 地西泮 1.668 0.41 3.81 30 100 0.9997 3.79 101.2 劳拉西泮 1.742 0.32 4.78 300 1000 0.9975 5.15 106.9 硝西泮 1.768 0.37 1.64 20 65 0.9993 3.91 110.9 普罗地芬 1.771 0.27 2.43 15 40 0.9996 1.61 106.9 奥沙西半 1.862 0.23 2.04 150 500 0.9952 2.15 105.8 可卡因 1.994 0.39 1.42 10 40 0.9998 1.27 98.5 维拉帕米 2.147 0.29 3.09 <5 10 0.9998 1.99 105.6 曲唑酮 2.370 0.25 4.04 <5 10 0.9993 3.61 112.1 羟考酮 2.478 0.29 3.65 40 130 0.9951 5.34 105.8 哌替啶 2.494 0.26 4.53 6 20 0.9951 2.42 105.5 MDEA 2.506 0.18 3.48 <5 10 0.9956 3.31 104.1 海洛因 2.518 0.27 3.53 40 150 0.9983 3.18 106.3 PCP 2.550 0.22 2.73 15 55 0.9991 2.34 110.1 安非他明 2.592 0.17 3.34 20 70 0.9943 2.29 93.1 MDA 2.631 0.16 4.34 60 200 0.9995 2.86 95.2 甲基苯丙胺 2.839 0.15 4.67 <5 10 0.9983 4.24 105.5 MDMA 2.900 0.16 3.13 10 30 0.9991 2.69 105.6 美沙酮 2.947 0.15 2.86 10 30 0.9998 2.43 102.4 阿普唑仑 3.228 0.13 2.13 10 30 0.9995 2.89 105.8 可待因 3.290 0.19 4.39 20 50 0.9931 3.83 111.8 氢可酮 3.631 0.21 2.91 25 80 0.9931 2.73 112.3 士的宁 4.055 0.13 1.15 50 150 0.9992 1.28 100.3 图 2.用 SFC 分离法在5分钟的运行时间内对含25种药物的混合物进行分离并用 DMRM 进行检测 作为示例，对加标尿液样品中的安非他明类化合物进行更详细的分析。样品加标浓度为 100 ng/mL，用甲醇按 1：5的比例进行稀释，得到最终浓度20 ng/mL，并将其进样分析，如“实验部分”所述。在较短的梯度条件下(甲醇含量在5分钟内从2%增加至25%)，五种安非他明化合物在2.4至3.1分钟之间洗脱(图3)。为进行更精确的评估，将样品进样分析10次。由重复进样分析计算得出的保留时间和浓度的 RSD 分别为0.4%以下和3%以下。浓度准确度处于82%-101%的范围内，这对于定量分析来说非常出色(表3)。 图3.加标尿液样品(100ng/mL，用甲醇按 1：5的比例稀释)中20 ng/mL的安非他明类化合物(安非他明、甲基苯丙胺、MDA、MDMA 和 MDEA) 表3.利用SFC/三重四极杆质谱仪得到的加标和经稀释的尿液样品中安非他明的定量测量结果 RT RT RSD 实测浓度 浓度精度 RSD 浓度准确度 化合物 (min) (%) (ng/mL) (%) (%) MDEA 2.466 0.42 19.61 2.75 97.98 安非他明 2.554 0.42 16.41 3.03 82.05 MDA 2.595 0.37 20.19 1.37 100.95 甲基苯丙胺 2.813 0.21 17.27 1.75 86.35 MDMA 2.860 0.17 17.71 2.16 88.55 作为示例，浓度范围为 0.2 ng/mL 至最高100 ng/mL 的 MDA 获得的校准曲线表现出高达0.9995的优异线性系数。由浓度为20 ng/mL的所测样品获得的定量离子和定性离子表现出良好的峰形，它们的比例处于预期范围内(图4)。 结论 本应用简报介绍了利用 Agilent 1260Infinity 分析型 SFC 系统对大量药物的快速分离。将 SFC 系统与 Agilent 6460三重四极杆质谱仪相结合，能够实现快速筛查和定量分析。所有化合物均在较短的5分钟梯度条件下得到洗脱和分离，并获得了较高的保留时间和峰面积精度(分别为0.3%和4%)。所有校准曲线均表现出优异的线性，LOD 低于 30 pg/mL， 证明可实现高灵敏度分析。浓度精度低于3.5%，准确度介于95%禾105%之间。通过定量分析加标尿液样品中的安非他明类物质，展示了对法医毒理学样品的分析性能。结果证明，加标化合物的浓度以优异的浓度精度和准确度测得。 浓度(ng/mL) 图4.加标尿液样品中MDA 的定性测量。A)浓度为20 ng/mL 的 MDA 的定量离子。B)定量离子、定性离子及其比例。C) MDA 的 MS/MS 谱图。 D) MDA 在 0.2 ng/mL 至100 ng/mL 之间的校准曲线，线性相关系数为 0.9995。实测浓度如箭头所示 1. 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