各种溶液样品过滤过程中滤膜是否会释放浸出物检测方案

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SARTORIUS应用文章 2020年7月23日 关键词或短语： 浸出物、过滤膜片、洗脱液过滤、HPLC、HRMS 在真空过滤时，滤膜是否会向流动相中释放浸出物? Klaus Schone1，*，Stephanie Schweizer， Tanja Verena Maier2，*Roberto Menzel2 1.Sartorius Lab Instruments GmbH & Co.KG，Otto-Brenner-Str. 20， 37079 Gottingen， Germany 2.Sartorius Stedim Biotech GmbH August-Spindler-Str.11，37079，Goettingen， Germany *通信联系 电子邮件： tanja.maier@sartorius.com，klaus.schoene@sartorius.com 摘要 对洗脱液进行真空过滤是保护色谱柱不受颗粒物影响的一种常见做法。滤膜与溶剂接触时产生的浸出物可能会在色谱分析中产生干扰。因此，对赛多利斯过滤膜片进行测试，以确定通过这些滤膜进行洗脱液过滤后，在洗脱液中是否会检测到浸出物。使用纯水、磷酸盐缓冲液及纯乙腈等溶剂模拟要过滤的典型洗脱液。将再生纤维素(RC)和聚酰胺(PA)这两种最经常使用的滤膜作为过滤材料，对0.2um孔径的滤膜进行了测试。使用HPLC-UV/VIS和HRMS进行测试，RC滤膜的谱图与对照品并无差异，但是PA滤膜的谱图出现了一些小杂峰。通过测定两种膜过滤水后滤液的总有机碳(TOC)含量，为这一测试结果提供了数据支持。总体来看，浸出物的含量非常低。因此，可以得出以下结论：在大多数应用中，由RC和PA制成的过滤膜片非常适合对洗脱液进行过滤。 引言 随着基于密集填充柱的色谱方法的不断发展，如在HPLC或UHPLC中所使用密集填充柱，其色谱性能(分析物的分离)与普通填充柱相比有了显著提高，现在已成为常规分析中不可缺少的一部分。但是，使用5pm或更小二氧化硅颗粒作为填充柱的固定相，填充密度高，从而导致色谱柱对颗粒杂质极为敏感。固定相堵塞会降低分析结果的质量，并可导致分析系统停机从而产生附加成本。通过将各种技术相结合，例如入口过滤器、保护柱以及用于样品过滤的针头过滤器或用于缓冲液过滤的过滤膜片等，将这种风险降至最低。在本应用中，我们要强调刚刚提到的最后一种技术，即使用过滤夹具和孔径为0.2um的插入式过滤膜片，对水和/或有机流动相进行真空过滤。这种类型的洗脱液过滤在经济高效的常规分析中的应用特别广泛。它可以从相应的溶剂中去除微粒杂质，如沉淀物或灰尘颗粒，同时许多用户还会发现，它还具备利用真空同时对溶剂进行除气的优点(文献1、2)。 然而，这种类型的过滤涉及到洗脱液和滤膜之间的接触。这就存在一个风险，即化合物会从膜中浸出，并且产生不希望出现的干扰峰或增加背景噪音，甚至造成"不符合质量标准"的情况。 为了研究真空膜过滤向对应洗脱液释放浸出物的影响，我们选择了两种典型的过滤膜材质进行测试，即再生纤维素和聚酰胺(尼龙)。使用这两种过滤膜材质对常用的溶剂(如纯水、乙腈和NaH，PO缓冲液)进行过滤。通过HPLC-UV/VIS、TOC和高分辨率质谱(HRMS)对滤液中的浸出物进行分析，并将结果与相应的对照品进行对比。 方法 我们选择了孔径为0.2um的两种不同的赛多利斯滤膜材料，再生纤维素(RC，18407， 批号1704923)和聚酰胺(25007，批号1852193)。将所选过滤膜装配于玻璃过滤器上(全玻璃真空过滤夹具，16309)，通过过滤不同类型的溶液，来测试其在洗脱液过滤方面的性能。将所过滤的溶液用作洗脱液，使用HPLC-UV/VIS(纯水和NaH，PO缓冲液)和LC-HRMS(乙腈)进行分析，在直接输入模式下生成洗脱液特定的质谱图，以此对其进行测试。乙腈(p.a.Honeywell或LC级)购自Sigma-Aldrich。将纯水(RO水)用作洗脱液，并且用其配置10mm NaH，PO缓冲液， 以进行HPLC-UV/VIS分析。 ( 此外，分析了纯水经再生纤维素RC膜或聚酰胺膜过滤后的 TOC。 ) 在岛津TOC-V CSH(自动进样器：ASI-V)仪器上进行TOC分析。通过装配有各自膜材料的过滤器夹具，总计对350-400mL纯水(TOC<50ppb)进行了过滤。此外，溶液在没有滤膜的情况下通过滤器夹具。将这些对照情况用作空白对照。 高分辨率质谱(HRMS)分析使用的系统为来自Waters的Xevo G2-XS ESI-QToF质谱分析仪。MS参数：质量范围m/z50-1500；离子源温度120℃；锥孔气流速50L/h，去溶剂气温度550℃，流速950L/h；碰撞模式：从15到40eV递增，在ESI负电离和ESI正电离模式下运行分析。数据处理软件为UNIF|TM 第1.8.2版。 HPLC-UV/Vis检测在装配有VWD检测器的Agilent 1200Infinity仪器上进行。注入人工测试纯水样品。使用前端装有Nucleosil 100-5 C18保护柱(5umx3mm，100A)的NucleosilC18色谱柱(5umx250mmx4.6mm，100A)进行梯度分离。测试中，通过过滤夹具过滤滤脱液溶剂：A)纯乙腈和B)纯水或NaH2PO4缓冲液。HPLC-UV/VIS分析使用的乙腈未经过滤。条件如下：流速1mL/min，柱温40℃，进样体积20pL，检测波长220nm。所用梯度如表1所示。 表1：HPLC-UV/VIS的梯度参数 0-10 min 等度10/90乙腈/水溶液 10-35 min 梯度40/60乙腈/水溶液 35-70min 等度90/10乙腈/水溶液 结果与讨论 使用三种不同的分析方法对过滤膜片中潜在的浸出物进行检测和分析。该结果提供了样品中有机污染物的初步估计结果。使用HPLC-UV/VIS来考察在常规分析中，在实际条件下不同滤膜对于洗脱液过滤的影响。此外，高分辨质谱法(HRMS)这一检测方法灵敏度高，被用于生成特定洗脱液的质谱图，并能够从其质谱信号中鉴定可能的"污染物”。 对照品及两种滤液的TOC值均在<200ppb(ng/mL)范围内，说明其有机污染物含量水平非常低。通过PA膜过滤后的滤液的TOC值稍高，说明这些样品中有机物的含量稍高。 表2： HPLC-UV/VIS的梯度参数 样品 TOC [ng/mL] 对照 125 0.2um再生纤维素 150 0.2um聚酰安 200 模型洗脱液的HPLC-UV/Vis分析结果如图1中色谱图所示：NaH，PO缓冲液(上图)和纯水洗脱液(下图)。 图1：上图：经玻璃过滤器过滤的NaH，PO缓冲液样品的HPLC-UV/VIS色谱图：无膜(左)，0.2um再生纤维素膜(中间)及0.2um聚酰胺膜(右)。 下图：经玻璃过滤器过滤的水样品的HPLC-UV/VIS色谱图：无膜(左)，0.2um再生纤维素膜(中间)及0.2um聚酰胺膜(右)。 大体而言，色谱图显示了非常低的色谱背景和低水平的污染物含量。我们观察到，通过聚酰胺膜过滤的NaH，PO 洗脱液在梯度分离开始时出现了一些峰，表明存在有机化合物，经鉴定，这些化合物为聚酰胺低聚物。这一结果可信度非常高，也证实了该膜过滤的水样品的TOC值略高。总的来说，这两种滤膜都非常适合进行洗脱液过滤。然而，建议在HPLC应用中使用聚酰胺膜时，洗脱梯度的起始值由较高的有机溶剂组成。这样可以降低这些聚酰胺低聚物的潜在预浓缩，从而尽量减小色谱图开始时的紫外信号。这可能会解决洗脱液相关信号和分析物信号可能重叠的问题。 采用高分辨质谱法测定两种膜对乙腈的影响，因为乙腈是重要的萃取溶剂。由于缓冲液自身存在背景信号，因此无法测试NaH，PO 缓冲溶液。过滤后乙腈的质谱如图2所示。 大体而言，洗脱液和对照品的所有质谱图只有微小的差别。在ESI负电离模式下，两种膜过滤液的谱图相当，与对照品一样低。这相当于常见溶剂背景信号。 图2：用高分辨率质谱法对两种膜过滤所得的洗脱液进行对比。在ESI[-](上图)和ESI[+](下图)电离模式下，直接注入高分辨率质谱：对照品(左)，0.2um再生纤维素膜过滤样品及0.2um聚酰胺膜过滤样品(右)。质谱强度范围为2.5-10(ESI[-])及1.5-107(ESI[+])，质量范围为m/z 50-m/z1500。 在ESI正电离模式下所得的乙腈滤液质谱显示了一些PA膜的小信号，这些信号可能归属为聚酰胺低聚物。这个结果与该过滤膜材料的TOC和HPLC-UV/VIS结果一致。然而，值得注意的是，质谱信号是从滤液本身中记录的。在常规的色谱分离中，由于这些附加的质谱信号是在早期洗脱时出现的，并且可以在质谱分析中与分析物信号区分开，因此影响较小。 我们评估了两种过滤材料(RC和PA)在对液相色谱分析中常用的溶剂/洗脱液进行过滤时释放有机化合物的可能性。在使用经再生纤维素膜过滤的纯水和磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行HPLC-UV/VIS分析时，谱图中没有出现杂峰。在对经聚酰胺膜过滤的洗脱液进行HPLC-UV/VIS分析以及进行LC-HRMS质谱分析时，早期能检测到小的洗脱峰，这可能是聚酰胺低聚物导致的。TOC结果证实再生纤维素滤膜没有向纯水滤液中释放可检测的有机物。聚酰胺滤膜可能会释放少量的有机物，在其应用中应考虑这一点，例如可以通过调整梯度来减少影响。 基于这些结果，我们可以得出结论：再生纤维素滤膜和聚酰胺滤膜均适用于在液相色谱分析中对水或有机流动相进行过滤。再生纤维素滤膜是洗脱液过滤的首选，因为它的有机化合物释放量极低，并且与大多数溶剂都能很好地兼容。聚酰胺滤膜是理想的替代品，可用于对高或低pH的洗脱液进行过滤。了解该材料会释放聚酰胺低聚物，在开发HPLC-UV/VIS方法时加以考虑。 ( 1. Terri Thompson， Ti p s for Preparing and Using Bufferswith Your Chromatography System， March 14 ， 2016， h ttp s ：// w w w. b i ocom p a re . c o m /Be nc h - Ti p s/1839 7 5 - T ip s- f o r- P rep a r i ng-a n d- U sing -B uf f er s -wi t h - Y o ur - C hrom a to graph y -S y st em/ ) ( 2. Michael W.Dong， M odern HPLC for Practicing Scientists， 2006， p. 115f， ISBN-13：978-0-471-72789-8 ) 缩写 RC 再生纤维素 PA 聚酰胺(尼龙) (U)HPLC (超)高效液相色谱法 UV/VIS 紫外可见分光光度法 HRMS 高分辨率质谱法 ESI 电喷雾电离 TOC 总有机碳 销售与服务联系方式 更多联系信息，请访问 www.sartorius.com.cn 赛多利斯(上海)贸易有限公司 邮箱 lab.cn@sartorius.com 服务热线 400 920 9889| 800 820 9889 上海北京上海市浦东新区盛荣路 388北京市顺义区空港工业区 B弄百佳通产业园3号楼区裕安路 33号， 1013007-11层，200120电话+86 10 8042 6300 电话+86 21 6066 6100 苏州广州 苏州市虎丘区科技城锦峰路广州市越秀区水荫路 117 号 158 号 101park-28 幢201，1105单元， 510075 215163电话+86 20 3761 7284 电话+86512 6616 0490 成都西安成都市上东大街 246 号新良西安市和平路 118 号和平银大厦2406室， 610012座1107室， 710001电话+86 28 8666 6877电话 +86 29 87512305 ( 技木规格如有变更，恕不另行通知。 ) ( 赛多利斯保留最终解释权和修改权。 ) ( 版本03| 2 021 ) 关注赛多利斯实验室 针头滤器和滤膜是分析实验室的常用耗品，相信实验汪宝宝们都不陌生。在液相色谱检测之前，一般需要对样品和流动相进行预处理，除去颗粒杂质以保护色谱柱和仪器设备。样品过滤通常用针头滤器；流动相的预处理则通常用真空抽滤（全玻璃夹具+过滤膜片）的方法，可以从相应的溶剂中去除颗粒杂质，如沉淀物或灰尘，同时也可对流动相进行脱气。色谱分析实验有时候会很伤脑筋，因为滤膜与流动相接触时，有可能会产生浸出物，对色谱分析产生干扰。比如，赛多利斯的科学家们最近做的一个研究，实验结果表明，再生纤维素RC膜不会释放浸出物，而聚酰胺PA (尼龙) 膜可能会释放少量的有机物。在此项研究中，评估了再生纤维素RC膜和聚酰胺PA膜（尼龙）这两种常用滤膜在对液相色谱分析中常用溶剂/洗脱液进行过滤时，释放浸出物的可能性。使用经RC膜过滤的纯水和磷酸盐缓冲液作为洗脱液进行HPLC-UV/VIS和LC-HRMS分析时，谱图中没有出现杂峰。而在对经PA 膜过滤的洗脱液分析时，早期能检测到小的洗脱峰，这可能是聚酰胺低聚物导致的。即聚酰胺滤膜可能会释放少量的有机物，在其应用时应考虑这一点。同理，在样品过滤过程中，针头滤器在与样品接触时也可能会有这样的风险。因此可见，再生纤维素RC膜是样品/流动相过滤的优选，因为它的有机化合物释放量极低，不会对分析结果造成干扰。RC膜材质纯净，并且化学兼容性广泛。不仅非常适合有机溶剂/混合溶剂的过滤，如DMSO 和酮类/酯类/醚类等常用有机溶剂均可过滤，同时也能过滤水溶液，是真正的多用途滤膜。 具体实验情况如何，让我们一探究竟吧：实验滤膜：  0.2μm孔径的再生纤维素RC膜和聚酰胺（尼龙）PA膜实验溶剂： 纯水、NaH2PO4缓冲液、纯乙腈三种溶剂，模拟要过滤的洗脱液实验方法：HPLC-UV/VIS紫外可见分光光度法、TOC、高分辨率质谱（HRMS）  实验1  使用HPLC-UV/VIS来考察在常规分析中不同滤膜对于洗脱液过滤的影响实验结果表明，总体来看，浸出物的含量非常低。聚酰胺PA膜过滤的洗脱液，早期能检测到洗脱峰。RC滤膜的谱图与对照品并无差异。  实验2  分析纯水经再生纤维素RC膜或聚酰胺PA膜过滤后的TOC实验结果表明，对照品及两种洗脱液提取物的TOC值均在≤200ppb（ng/mL）范围内，说明其有机污染物含量水平非常低。不过通过PA膜过滤后的滤液的TOC值稍高，说明这些样品中有机物的含量稍高。  实验3  采用高分辨质谱法HRMS测定两种膜对乙腈的影响过滤后乙腈的质谱如下图所示：实验结果表明，洗脱液和对照品的所有质谱图只有微小的差别。但在ESI正电离模式下所得的乙腈滤液质谱图显示了一些PA膜的小信号，这些信号可能归属为聚酰胺低聚物。这个结果与该过滤膜材料的TOC和HPLC-UV/VIS结果一致。获取更多研究实验细节 点击下载获取应用手册