猪肉中病原微生物检测方案(PCR)

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非洲猪瘟的分子检测可行性方案 2018年7月19日 广州迪澳生物科技有限公司 目 录 1 非洲猪瘟简介 1 1.1 非洲猪瘟的发病机制及其症状 1 1.2 非洲猪瘟所带来的危害 1 2 非洲猪瘟在我国的发病情况 2 3 实时恒温扩增荧光PCR技术 2 4 产品系列 4 4.1 DEAOU-308C恒温荧光检测仪 4 4.2 配套试剂 4 4.3 售后服务 4 4.4 迪澳恒温扩增荧光检测系统优势 4 5 实验室检测能力建设 5 6 客户案例（部分） 6 附件1. 迪澳恒温扩增荧光检测系统 8 附件2. DEAOU-308C技术参数表 11 附件3 分子检测流程图 13 1 非洲猪瘟简介 非洲猪瘟（英文名称：African Swine fever，简称：ASF）是由非洲猪瘟病毒（英文名称：African Swine fever virus，简称：ASFV）感染家猪和各种野猪（如非洲野猪、欧洲野猪等）引起一种急性、出血性、烈性传染病。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和痘病毒科。病毒粒子的直径为175－215纳米，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170－190kb。在猪体内，非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞浆中，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。 1.1 非洲猪瘟的发病机制及其症状 ASFV可经过口和上呼吸道系统进入猪体，在鼻咽部或是扁桃体发生感染，病毒迅速蔓延到下颌淋巴结，通过淋巴和血液遍布全身。强毒感染时细胞变化很快，在呈现明显的刺激反应前，细胞都已死亡。弱毒感染时，刺激反应很容易观察到，细胞核变大，普遍发生有丝分裂。发病率通常在40%-85%之间，死亡率因感染的毒株不同而有所差异。高致病性毒株死亡率可高达90-100%；中等致病性毒株在成年动物的死亡率在20%-40%之间，在幼年动物的死亡率在70%-80%之间；低致病性毒株死亡率在10%-30%之间。 自然感染潜伏期5～9天，往往更短，临床实验感染则为2～5天，发病时体温升高至41℃ ，约持续四天，直到死前四十八小时，体温始下降为其特征，同时临床症状直到体温下降才显示出来，故与猪瘟体温升高时症状出现不同，最初三至四日发热期间，猪只之食欲，显出极度脆弱，猪只躺在舍角，强迫赶起要它走动，则显示出极度累弱，尤其后肢更甚，脉搏动快，咳嗽，呼吸快约三分之一，显呼吸困难，浆液或粘液脓性结膜炎，有些毒株会引起带血之下痢，呕吐，血液变化似猪瘟，从三至五个病例中，显示有50%之白血球数减少现象，淋巴球也同样减少，体温升高时发生白血球性贫血，至第四日白血球数便降至40%才不下降，未成熟中性球数增加也可观察到，往往发热后第七天死亡，或症状出现仅一、二天便死亡。 临床表现为发热（达40~42℃），心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。 1.2 非洲猪瘟所带来的危害 我国是养猪及猪肉消费大国，生猪出栏量、存栏量以及猪肉消费量均位于全球首位，生猪的养殖量和存栏量约占全球总量的一半，同时猪肉也是居民主要肉品蛋白质来源，猪肉消费占到总肉类消费的60%以上。根据人民网和新华网的报道，非洲猪瘟并不是人畜共患病，从研究情况来讲也不太可能变异出传染人的情况。 虽说非洲猪瘟不会传染给人，但其对猪来说则是非常致命的，非洲猪瘟的发病率和死亡率最高可达100％，而且发病周期短，病毒传播迅速，病毒能从被感染猪之血液、组织液、内脏，及其他排泄物中证实出来，低温暗室内存在血液中之病毒可生存六年，室温中可活数周！然而目前世界范围内仍没有研发出可以有效预防非洲猪瘟的疫苗。一旦确认是非洲猪瘟，当地县级以上地方人民政府畜牧兽医行政管理部门会派人到现场，划定疫点，疫区，受胁迫区，采集病料，调查疫源，采取隔离、扑杀、销毁、消毒等强制性控制、扑灭措施，迅速扑灭疫情。在封锁期间，禁止染疫和疑似染疫的动物和动物产品流出疫区，禁止非疫区的动物进入疫区。 所以一旦爆发非洲猪瘟，对于养户来讲无疑是一场巨大的灾害，给养户带来巨大的经济损失，因此非洲猪瘟也被称之为养猪业的“头号杀手”。 2 非洲猪瘟在我国的发病情况 自2018年8月3日我国确诊首例非洲猪瘟疫情以来，我国已经在辽宁、安徽、黑龙江等地接连爆发非洲猪瘟疫情。最近一起在海南海口市爆发： 2019年4月21日，农业农村部接到中国动物疫病预防控制中心报告，经海南省动物疫病预防控制中心确诊, 海南省海口市秀英区一养殖户、澄迈县两养殖户、保亭黎族苗族自治县一养殖户、陵水黎族自治县两养殖场户发生非洲猪瘟疫情。截至目前，海口市秀英区发生疫情养殖户共存栏生猪252头，发病252头，死亡43头；澄迈县发生疫情两养殖户共存栏生猪172头，发病62头，死亡62头；保亭黎族苗族自治县发生疫情养殖户共存栏生猪7头，发病7头，死亡7头；陵水黎族自治县发生疫情两养殖场户共存栏生猪86头，发病34头，死亡34头。疫情发生后，农业农村部立即派出督导组赴当地。当地已按照要求启动应急响应机制，采取封锁、扑杀、无害化处理、消毒等处置措施，对全部病死和扑杀猪进行无害化处理。同时，禁止所有生猪及其产品调出封锁区，禁止生猪运入封锁区。目前，上述措施均已落实。 尽管非洲猪瘟传入我国仅一年的时间，但已经在多地接连爆发，造成了巨大的经济损失，而且非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。在目前的情势下，急需一种能对非洲猪瘟进行快速检测的方案！ 3 实时恒温扩增荧光PCR技术 核酸等温扩增技术（isothermal nucleic acid amplification technology）是指一类分子生物学技术的总称，它们能在某一特定的温度下，扩大特定DNA或RNA片段的拷贝数。与上述两种PCR方法相比，核酸等温扩增技术的特点是可在特定温度条件下实现核酸的扩增。由于扩增反应的全过程均在同一温度下进行，使它们对仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，可通过加热模块、水浴槽等简单的设备完成反应。实时恒温扩增荧光PCR法是核酸等温扩增技术的一种，是通过Bst-DNA聚合酶及特异性引物在恒温条件下对特定的核酸片段进行特异性扩增，扩增产物（DNA）与核酸染料结合后发出荧光信号，根据所产生的扩增曲线判断结果。实时恒温扩增荧光PCR法具有如下特点： （1）温度恒定。反应是在连续等温的条件下进行，不用花费时间来改变温度； （2）高效灵敏。在45-60 min的时间内，其扩增效率可达到l0l0 个数量级；扩增模板极限仅为几个拷贝； （3）特异性强。采用4/6条引物，识别6个位点，特异的扩增靶基因； （4）检测费用低。只要一特定的温度就能完成扩增反应，不需要昂贵的精密仪器和特殊试剂，总费用低； （5）操作简便。不需要进行双链DNA的预变性；反应不需要开盖，在一管内即可以完成全部检测； （6）检测简单。结果可根据有无“S”型曲线进行判断，也可依靠仪器自动判读。 核酸等温扩增技术因其具有高特异性、高效率和快速反应的特点，故从2003年开始逐步被用于医学的临床检测，目前主要是病原微生物的检测和传染性疾病的诊断。应用核酸等温扩增技术在动物源性检测方面也有不少报道。Maruyama 等利用核酸等温扩增技术检测携带stx2 特异基因（其中一种编码毒素的基因）的大肠杆菌O157:H7。Ohtsuka等利用核酸等温扩增技术检测鸡蛋中的沙门氏菌，试验证明，核酸等温扩增技术比培养计数法和PCR 方法检测的效率都高，110 个样本中，有10%的阳性样本PCR 方法漏检，而核酸等温扩增技术的沙门氏菌阳性样本检出率是100%。程晋霞，曾静等采用核酸等温扩增技术对食品中过敏原牛奶成分进行检测，并与实时荧光定量PCR方法对比，结果发现核酸等温扩增技术的检测灵敏度为0.5%，与Real-time PCR方法检测灵敏度相当，69份实际样本的检测结果与Real-time PCR方法一致。另外，冉光耀也在其论文中报告了采用核酸等温扩增技术对猪、狐狸、大鼠、鸡和鸭源性成分进行检测，猪、狐狸、大鼠、鸡和鸭的各引物的灵敏度分别可达到500fg、500fg、50fg、5pg和50fg，具有良好的灵敏度；可检出自制掺假率为0.01%的模拟样品和用各种热处理方式处理过的生鲜肉；猪源性成分恒温PCR检测法与我国出入境检验检疫行业标准方法（SN/T2051-2008）相比，结果一致性达到了97.6%。 4 产品系列 主要包括DEAOU-308C恒温扩增荧光检测套装、配套试剂及售后技术服务。 4.1 DEAOU-308C恒温荧光检测仪 DEAOU-308C恒温扩增荧光PCR检测仪是由广州迪澳生物科技有限公司自主研发而成，采用现代微系统技术和最新的LED过滤处理技术，其检测灵敏度超越了主流的荧光检测系统（DEAOU-308C恒温扩增荧光检测仪参数详请见附件2）。 DEAOU-308C恒温荧光检测仪资质： 1）2014年2月17日，获得ISO9001质量体系认证证书 2）2014年3月15日：仪器企业标准获得备案 3）2014年5月5日：获得CQC产品认证证书 4）2014年11月24日：获得医疗器械注册证 5）外壳：外观设计专利 6）软件：软件著作权登记 4.2 配套试剂 产品名称 用途 备注 非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒（恒温荧光法） 用于非洲猪瘟病毒的检测 （最低检测限为1 fg/μL） 动物病毒基因组DNA提取试剂盒 (AmPure Viral DNA Kit) 提取组织/血液中病毒的核酸 — 4.3 售后服务 可根据客户需求定制开发相关的检测试剂盒产品，建立属于单位特色的检测项目。 提供规范的分子实验室建设方案。 提供人员培训，特派专业工程师上门指导服务，协助建立检测流程，会定期对实验操作人员进行培训。 提供转基因分子检测整体解决方案，在检测中出现的技术问题由专业工程师解答。 迪澳生物提供7×24h全方位的技术支持。 4.4 迪澳恒温扩增荧光检测系统优势 检测快速：45分钟内完成检测，提高工作效率； 结果准确：高灵敏度，高特异性； 操作简易：非专业人员无障碍操作； 多重检测：单次反应可检测1-16项不同指标。 5 实验室检测能力建设 5.1.1 非洲猪瘟病毒检测程序 图1 非洲猪瘟病毒检测流程图 5.1.2具体步骤 （一）样本前处理 组织等固体样本应取少量样本（10~30 mg）采用液氮研磨或加入生理盐水后用均质器进行均质，均质液用于病毒核酸提取。 血液等液体样本应取少量样本（100~300 μL）于1.5mL离心管中，10000 rpm离心3分钟，去除宿主细胞后用于病毒核酸提取。 （二）核酸提取（组织等固体样本） 取10~30mg动物组织样品，加入0.3~0.5ml生理盐水进行匀浆。 10,000 x g离心3分钟。 转移10µl上清液至新的离心管中, 加入100µl Buffer ADC至样品中。 室温或80℃放置10~15分钟。 (可选)加入50µl Buffer AF至样品中，涡旋混匀。 把样品保存于4°C或取1-4µl抽提液用于PCR。 （三）配制反应体系 试剂配制（在准备区进行，与扩增区分开，冰上操作） 若有n个待检样品，需配制n+2个反应（n个待检样品+1个阴性对照+1个阳性对照），将下表中试剂在EP管中混匀，按每管23 μl分装至0.2 ml PCR管中。 试剂 加入量（μl） 反应液 22 ×（n+2） Bst聚合酶 1.0 ×（n+2） 总体积 23 ×（n+2） 加样（在标本处理区进行，冰上操作） 在上述含有混匀试剂的PCR管中加入20μl的密封液（如扩增仪器带热盖可不加密封液），随后加入2μl模板（加样顺序为阴性对照、待检样品、阳性对照），10,000 rpm离心30s，即可上机检测。 （四）上机检测（在扩增区进行） 将反应管置于仪器恒温扩增荧光检测仪中，编辑实验名称，选择检测时间，点击开始检测。 依据检测试剂盒的说明书进行实验结果的判定。 6 客户案例（部分） 赣州朱师傅预混饲料事业有限公司 购买Deaou-308C恒温荧光检测仪、沙门氏菌、大豆内源基因检测试剂盒、非洲猪瘟核酸核酸检测试剂盒，用于饲料的配料——饲料中沙门氏菌、大豆成分和非洲猪瘟病毒的检测。 河南省质量技术监督管理局 使用非洲猪瘟核酸核酸检测试剂盒，用于以猪肉原料的食品中非洲猪瘟病毒的检测，如水饺等。 湖南省食品质量监督检验研究院 使用非洲猪瘟核酸核酸检测试剂盒，用于以猪肉原料的食品中非洲猪瘟病毒的检测。 天津市食品技术安全研究院 使用非洲猪瘟核酸核酸检测试剂盒，用于以猪肉原料的食品中非洲猪瘟病毒的检测。 山东中质华检测试检验有限公司 购买非洲猪瘟核酸核酸检测试剂盒，用于客户送检的样本中非洲猪瘟病毒的检测。 广东省食品检验所 购买非洲猪瘟核酸核酸检测试剂盒，用于以猪肉原料的食品中非洲猪瘟病毒的检测。 12 附件1. 迪澳恒温扩增荧光检测系统 迪澳生物提供的恒温荧光PCR检测解决方案，简便易行，主要仪器设备可浓缩在一个行李箱大小的空间（图3）；检测操作也相当简单；自主开发的恒温荧光检测仪可实现结果自动判断，以“+”和“−”号表示阳性和阴性结果，无需专家解读；因此可以为贵单位提供准确、先进的检测手段的同时，节约实验室建设投入。 图3 迪澳恒温扩增荧光检测箱 序号 产品名称 图片 技术参数 用途 数量 1 恒温扩增荧光检测仪 检测原理：基于实时荧光信号检测的恒温PCR技术，无需升降温即可完成实验，可用于微生物、动物源性等项目的实时检测。 检测孔：≥16孔；反应体积：10～100µL；设备移动后无需校准，兼容常规分子实验耗材。 检测仪器自带触屏显示功能。 简单的结果显示方式：1）扩增曲线；2）出峰时间；3）检测结果。 结果打印：设备有打印输出功能，可连接热敏打印机实时打印检测结果。 系统功能1：独立系统，通过屏幕操作；仪器中可实现数据的存储、调出、结果分析、统计和报告；全中文的检测系统操作界面和电脑端操作软件，软件免费更新。 系统功能2：具有数据通信端口，可上传检测数据。 动物源性食品，食源性致病菌等检测项目 1 2 迷你离心机 转速：10000转/分 相对离心力：约7500g 外型尺寸：176×156×121（mm） 样品处理量：8×2.0mL/1.5mL/0.5mL/0.2mL离心管 （另配0.5mL和0.2mL离心套管） 定时范围：5s—99min59s 样品处理 1 3 金属浴 控温范围：室温+5℃-100℃ 模块温度均匀性：≤±0.3℃ 温度显示精度：0.1℃ 最高温度：100℃ 产品重量：≤1kg 样品处理 1 4 快速混匀器 振荡方式：圆周振荡 周转直径：4.5 mm 振荡量(1个试管)：max. 50mL 振荡转速：3,300rpm 外形尺寸：110×70 mm 样品处理 1 5 移液器 规格100 - 1000μL 规格10 - 100μL 规格0.5 - 10μL 样品处理 3 表1 迪澳恒温扩增荧光检测系统设备与参数 附件2. DEAOU-308C技术参数表 描述 特性 工作电压 100～240V，50～60Hz 最适工作环境温度 15～30℃ 储存温度 ﹣20℃～+55℃ 环境相对湿度 20%～85% 电源 19.5V6.15A 加热方式 半导体 升温速率 1℃/秒以上 温控范围 室温～85℃ 控温精度 ±0.2℃ 温度准确度 ±1℃ 模块温度均匀度 ±1℃ 热盖 具有热盖功能 检测孔 16孔 反应体积 10～100 µl 耗材 0.2ml离心管或8联管 检测方式 实时荧光信号检测 检测光源 LED灯 滤光系统 双色荧光滤光片（460-480nm，510-530 nm） 激发光波长 470nm 检测光波长 520nm 定性或定量 可进行定性和半定量检测 结果显示方式 1）扩增曲线；2）出峰时间；3）检测结果 判读方式 1）根据扩增曲线判读；2)仪器自动判读 检测试剂 开放式恒温荧光检测试剂 操作软件 安卓软件及计算机软件 控制方式 本机触屏或计算机 最大反应时间 180分钟 尺寸 长375mm×宽315mm×高135mm 净重量 4.45 kg 外接设备 电脑（自备） 技术资料 全套安装、操作和维护使用说明书 软件更新 软件免费更新 质量保修期 1年免费维修，3年维护 资质 ISO 9001质量认证，CQC认证 附件3 分子检测流程图 图4 动物源性分子检测流程图 图5 致病微生物分子检测流程 非洲猪瘟（英文名称：African Swine fever，简称：ASF）是由非洲猪瘟病毒（英文名称：African Swine fever virus，简称：ASFV）感染家猪和各种野猪（如非洲野猪、欧洲野猪等）引起一种急性、出血性、烈性传染病。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和痘病毒科。病毒粒子的直径为175－215纳米，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小170－190kb。在猪体内，非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞浆中，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。