奶粉中核苷酸检测方案(液相色谱仪)

智能文字提取功能测试中

SSL-CA20-512Excellence in Science Excellence in ScienceLC-244 岛津企业管理(中国)有限公司-分析中心Shimadzu (China) Co.， LTD. -Analytical Applications CenterEmail： sshzyan@shimadzu.com.cn Tel：86(21)34193996http：//www.shimadzu.com.cn Nexera LC-40测定婴幼儿奶粉中核苷酸含量 LC-244 摘要：本应用建立了婴幼儿奶粉中核苷酸的测定方法。参照《GB 5413.40-2016食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》对样本进行前处理并上机测定。结果表明：胞嘧啶核苷酸(CMP)、尿嘧啶核苷酸(UMP)、鸟嘌呤核苷酸(GMP)、腺嘌呤核苷酸(AMP)和次黄嘌呤核苷酸(IMP) 在0.2 ug/mL~80 ug/mL 浓度范围内线性关系良好，所得校准曲线相关系数均在0.9994以上，各校准点准确度在96.2%~104.8%之间；精密度结果显示，所有组分保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.05%和1.80%以内；加标回收率结果在85.75~91.43%之间。 关键词：婴幼儿奶粉 核苷酸 Nexera LC-40 高效液相色谱仪 核苷酸是由含氮的碱基、环状核糖或脱氧核糖、磷酸3种分子连接而成，碱基与糖通过糖苷键连接成核苷，核苷与磷酸以酯键连接，组成核苷酸。目前婴幼儿配方奶粉中核苷酸的添加形式主要有5种，胞嘧啶核苷酸 (CMP)、尿嘧啶核苷酸 (UMP)、腺嘌呤核苷酸(AMP)、鸟嘌呤核苷酸 (GMP)和次黄嘌呤核苷酸 (IMP)。核苷酸可以增强婴儿的机体免疫力和抗感染能力，特别是在新生儿维持机体免疫系统功能、促进肠道成熟、肝脏的生长发育和代谢、脂质代谢等方面都发挥重要作用。 由于牛乳、羊乳中核苷酸含量和母乳差距较大，所以部分婴幼儿配方奶粉中会添加核苷酸以达到与母 实验部分 乳更加接近的目的。2005年，中国卫生部正式允许婴幼儿配方奶粉中添加核苷酸，我国对核苷酸的应用也逐步开始。国家标准《GB 14880-2012食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中规定了核苷酸在婴幼儿配方食品中的添加量为 0.12~0.58g/kg(以核苷酸总量计)。《GB 5413.40-2016食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》中规定， CMP、AMP、UMP、GMP和IMP的定量限分别为3.3 mg/kg、5.0mg/kg、5.0 mg/kg、5.0 mg/kg 和 6.7 mg/kg。 本文采用岛津高效液相色谱仪 Nexera LC-40 建立了5种核苷酸的测定方法，本方法灵敏度高、重现性好，适用于婴幼儿奶粉中核苷酸的检测。 1.1仪器、试药与试剂 1.1.1仪器 岛津 Nexera LC-40 XR高效液相色谱仪，配置信息如下： 系统控制器：CBM-40 自动进样器： SIL-40C XR 柱主箱： CTO-40C 输液泵：LC-40DXR脱气机：DGU-405 紫外检测器：SPD-40V 色谱工作站：Labsolutions Ver.5.101 1.1.2试药与试剂 胞嘧啶核苷酸 (CMP， 纯度97%)；尿嘧啶核苷酸(UMP，纯度93.7%))；；腺嘌呤核苷酸(AMP，纯度97.1%)；鸟嘌呤核苷酸 (GMP，纯度86.1%)；次黄嘌呤核苷酸 (IMP， 纯度96%)；磷酸氢二钾(HPLC级)；磷酸二氢钾(优级纯)；乙酸(HPLC级)；四丁基硫酸氢铵(离子对色谱专用，纯度98%)；甲醇(HPLC级)；纯净水。 1.2试剂配制 乙酸溶液(100 mL/L)：吸取10mL冰乙酸，用纯净水定容到100mL。 磷酸氢二钾溶液(0.1mol/L)：称取2.28g磷酸氢二钾，用纯净水溶解并定容到100mL. 磷酸盐缓冲液 (1.40 mmol/L 四丁基硫酸氢铵， 0.01 mol/L 磷酸二氢钾)：称取1.360g磷酸二氢钾，加0.4753g四丁基硫酸氢铵，加900mL水溶解，用磷酸氢二钾溶液调 pH至3.2，用纯净水定容到1000 mL。 1.3分析条件 色谱柱： Shim-pack GIST C18(250mm × 4.6 mml.D.， 5um；岛津(上海)实验器材有限公司；P/N： 227-30017-08) 流动相：磷酸盐缓冲液-甲醇(1000：40，v：v) 流速：1.0mL/min 进样量：10uL 波长：254nm 柱温：25℃ 1.4混合标准溶液的制备 精密称取CMP、UMP、AMP、GMP和IMP各10 mg，加入纯净水10 mL，配成浓度均为1mg/mL的中间溶液，分别取适量1 mg/mL的中间溶液混合，逐级稀释，配制成 CMP、UMP、AMP、GMP和IMP的浓度分别为 0.2ug/mL、0.4 ug/mL、1 ug/mL、4 ug/mL、10 ug/mL、20 ug/mL、40ug/mL和80 ug/mL的标准系列工作溶液。 样品前处理 称取混合均匀的5g奶粉样品于50mL的离心管中，加入20 mL温水(50℃)充分溶解试样，冷却至室温，用乙酸溶液(100 mL/L) 调试样溶液 pH 4.1， 移入50 mL容量瓶中定容，摇匀，转入离心机中，4℃条件下，12000 r/min离心5 min， 将上清液用 0.22 um 微孔滤膜滤过，备用。 结果与讨论 3.1色谱图 图1 标准溶液定量下限色谱图 3.2线性、检出限和定量限 将5种核苷酸混合标准工作溶液，按“1.3分析条件”进行测定，使用外标法定量。。以峰面积为纵坐标，对应的标准工作溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线，如图2所示。校准曲线线性关系良好，相关系数均大于0.9994，准确度在96.2%~104.8%之间。LabSolutions 软件依据信噪比自动计算检出限(S/N=3)及定量限(S/N=10)。线性方程、相关系数、检出限及定量限结果见表1。 图2 标准曲线 表1 线性关系、检出限和定量限结果 目标物名称 标准曲线 相关系数R 线性范围(ug/mL) 准确度% 检出限(ug/mL)定量限(ug/mL) AMP Y=26897.8X+1.58854 0.9995 0.2-80 96.8-104.5 0.02 0.04 CMP Y=9267.2X+46.0288 0.9995 0.2-80 96.2-104.0 0.01 0.03 UMP Y=18220.1X-99.8026 0.9994 0.2-80 96.7-104.8 0.02 0.05 GMP Y=22181.4X-5.54631 0.9995 0.2-80 96.9-104.7 0.02 0.05 IMP Y=23957.1X+46.5275 0.9995 0.2-80 96.9-104.8 0.02 0.05 3.3精密度 采用0.2 ug/mL 和 20 ug/mL标准工作溶液连续测定6次，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如表2所示。结果显示：不同组分保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.02%~0.05%和0.02%~1.80%之间，显示仪器精密度良好。 表2 保留时间和峰面积重复性结果(n=6) 理论浓度 保留时间 峰面积 理论浓度 保留时间 峰面积 目标物名称 ug/mL) (RSD%) (RSD%) (ug/mL) (RSD%) (RSD%) AMP 0.200 0.03 1.05 20.0 0.02 0.05 CMP 0.200 0.03 1.01 20.0 0.02 0.09 UMP 0.200 0.04 0.64 20.0 0.02 0.05 GMP 0.200 0.04 1.65 20.0 0.02 0.02 IMP 0.200 0.05 1.80 20.0 0.03 0.03 3.4加标回收率 分别精密称取已知5种核苷酸含量的市售奶粉样品6份，每份5g， 再加入一定量的核苷酸对照品储备液，按照“2.品前处理”方法处理后制备供试品溶液，上机分析，按以下公式考察察收率。 其中： C实测为实际测试浓度 C样品为样品浓度 C添加为添加浓度 添加浓度及加标回收率具体结果如表3所示，5种核苷酸的加标回收率在 85.75~91.43%之间。 表3 加标回收率结果 添加浓度 回收率1 回收率2 回收率3 回收率4 回收率5 回收率6 回收率 回收率 目标物名称 (mg/kg) (%) (%) (%) (%) (%) (%) 均值(%) RSD% AMP 50 86.02 85.92 85.80 85.80 85.52 85.46 85.75 0.26 CMP 100 87.92 88.34 88.69 88.33 87.72 87.74 88.12 0.45 UMP 60 87.72 87.50 87.48 87.31 87.08 87.02 87.35 0.31 GMP 20 90.85 91.05 91.80 91.90 91.75 91.25 91.43 0.49 IMP 30 89.07 89.37 89.43 87.30 88.87 88.97 88.83 0.89 3.5样品测定结果 精密称取市售某品牌奶粉样品6份，按照“2.样品前处理”方法处理及“1.3分析条件”进行测定，色谱图如图3所示。结果见表4，奶粉样品中核苷酸总量为0.29 g/kg， 在国家标准《GB 14880-2012食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》中规定的添加量 0.12~0.58 g/kg(以核苷酸总量计)范围之中。 图3 市售奶粉样品色谱图 表4样品测定结果 (ug/mL) 目标物名称 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 平均值 RSD% AMP 5.568 5.572 5.581 5.585 5.595 5.593 5.582 0.20 CMP 11.29 11.29 11.27 11.28 11.30 11.31 11.29 0.12 UMP 6.560 6.575 6.582 6.590 6.603 6.600 6.585 0.25 GMP 2.046 2.042 2.038 2.038 2.040 2.044 2.041 0.16 IMP 3.074 3.071 3.069 3.077 3.071 3.068 3.072 0.11 结论 本应用建立了采用岛津高效液相色谱仪 Nexera LC-40 测定婴幼儿奶粉中核苷酸的检测方法。该方法灵敏度高、重复性好，满足《GB5413.40-2016食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》中规定的定量限检测要求，为婴幼儿奶粉中核苷酸含量检测提供参考。 岛津应用云 本应用建立了婴幼儿奶粉中核苷酸的测定方法。参照《GB  5413.40—2016食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸的测定》对样本进行前处理并上机测定。结果表明：胞嘧啶核苷酸（CMP）、尿嘧啶核苷酸（UMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）和次黄嘌呤核苷酸（IMP）在0.2  μg/mL ~ 80  μg/mL浓度范围内线性关系良好，所得校准曲线相关系数均在0.9994以上，各校准点准确度在96.2%~104.8%之间；精密度结果显示，所有组分保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.05%和1.80%以内；加标回收率结果在85.75~91.43%之间。