双孢蘑菇中褐变和活性氧代谢检测方案(质构分析仪)

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食品工业科技一贮远保鲜 食品业科技贮运保鲜·Vol.37，No.14，2016 短时高压二氧化碳对双孢蘑菇褐变和活性氧代谢的影响 李 静，李顺峰，田广瑞，王安建，刘丽娜，魏书信 (河南省农业科学院农副产品加工研究中心，河南郑州 450002) 摘 要：为了探讨短时高压二氧化碳处理对双处蘑菇(Agaricus bisporus) 褐变和活性氧代谢的影响，采用优化好的0.3MPa二氧化碳短时处理双孢蘑菇，然后于4℃条件下贮藏8 d，测定双孢蘑菇褐变度、细胞膜透性、0，·生成速率、MDA、抗氧化物质和H，O，的含量以及自由基清除酶活性等指标。结果表明，短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇的短期保鲜效果并不理想。与对照相比，在4d贮藏贮内，0.3 MPa 二氧化碳短时处理提高了双孢蘑菇的褐变度、相对电导率、脂质过氧化产物 MDA的含量，促进了07·H，0等活性氧物质的积累，同时降低了 CAT 和 SOD 活性。然而随着贮藏时间的延长，逐渐显现出短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇的保鲜效果。在贮藏后期，0.3 MPa二氧化碳短时处理抑制了双孢蘑菇的褐变，降低了相对电导率和 MDA、07·、H，0，等的含量，提高了 CAT 和 SOD 的活性。此外，0.3MPa二氧化碳短时能够减少双孢蘑菇体内总酚和抗坏血酸的损失，进而抑制双孢蘑菇的褐变。 关键词：双孢蘑菇，短时高压二氧化碳处理，褐变，活性氧 Effect of treatment with short-time high-pressure carbon dioxideon browning and activate oxygen metabolism of Agaricus bisporus LI Jing，LI Shun-feng，TIAN Guang-rui，WANG An-jian，LIU Li-na， WEI Shu-xin ( Institute of Agro-products Processing，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002， China) Abstract： Mushrooms(Agaricus bisporus) were dipped for short time in 0.3 MPa Co，，then stored at 4℃ for 8 d.Changes of the browning， membrane permeability，lipid peroxidation， reactive oxygen species， and free radicalscavenging enzyme activity in the mushroom tissue were measured. The results indicated that the short- termpreservation effect of 0.3 MPa CO， treatment on A. bisporus was not ideal. Browning，relative leakage rate， theproduction rate of O·and the contents of MDA and H.O of A. bisporus dipped for short time in 0.3 MPa CO，，were increased with lower CAT and SOD activity during the first four days.However，the short-time high-pressureCO， treatment showed the preservation effect on A.bisporus as time prolonged.In the late storage，0.3 MPa CO，treatment inhibited the browning and decreased the relative leakage rate， the production rate of O·，and thecontents of MDA and H，O，.Moreover，the corresponding oxygen radical scavenging enzyme activities includingCAT and SOD in mushroom dipped for short time in 0.3 MPa CO， were higher than those in the control.In addition，0.3 MPa CO， treatment could reduce the loss of total phenolic and ascorbic acid of A.bisporus，and then inhibit thebrowning. Key words： Agaricus bisporus； high-pressure carbon dioxide； browning； reactive oxygen species 中图分类号：TS255.3 文献标识码：A 文章编号：1002-0306(2016)14-0308-06 双孢蘑菇(Agaricus bisporus)是以有氧呼吸为主的呼吸跃变型园艺产品，采后极不耐贮藏，常温仅可保存1~3d，其中褐变是导致双孢蘑菇感官品质降低的一个非常重要的因素11-51。研究发现，呼吸作用使双孢蘑菇贮藏期间产生活性氧，活性氧能够启动脂质过氧化反应，使维持细胞区域化的膜系统受到瓦解或损伤，进而诱发或加重褐变的发生-6。为了免 受活性氧的伤害，蘑菇体内同样存在着超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(CAT)等活性氧清除系统酶和总酚、抗坏血酸等抗氧化物质”。Liu 等人发现80%的高氧处理能够降低双孢蘑菇体内0·、H，O等活性氧的积累，同时提高 SOD、CAT的活性和总酚、抗坏血酸的含量，延缓细胞膜透性和脂质过氧化进程，进而达到抑制褐变的效果。 ( 收稿日期：2 015- 1 2- 2 2 ) ( 作者简介：李 静 (198 1-)， 女 ， 博 士 ，副研究员，研究方向：农产品贮藏及加工，E- m ail： ru o c henjl@ 163. c om。 ) ( 基金项目 ： 河南省农业科学院科研发展专项资金项目(20 1 4 8409) 。 ) 高压二氧化碳在低温条件下能有效杀菌和钝化酶的活性-10，从而抑制果蔬及其产品的品质劣变，目前已有高压二氧化碳处理应用到果汁、鲜切果蔬褐变控制和保鲜的相关报道19-14。前期研究发现短时高压二氧化碳处理能较好的保持双孢蘑菇贮藏品质，但是该处理对双孢蘑菇脂质过氧化和活性氧代谢的影响还不清楚。本研究旨在确定短时高压二氧化碳对双孢蘑菇褐变、细胞膜透性、丙丙醛(MDA)、抗氧化物质、活性氧积累、活性氧清除系统酶活性的影响，进一步探讨该处理对双孢蘑菇的作用机理，为短时高压二氧化碳在双孢蘑菇保鲜中的应用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 双孢蘑菇 购自洛阳奥达特食用菌技术开发有限公司，采收后分层放入贮运保鲜箱预冷后立即运回实验室进行处理，选取大小、成熟度一致、颜色洁白、无开伞、无病虫害和机械损伤的蘑菇进行实验；硫代巴比妥酸、三氯乙酸、氢氧化钠、没食子酸、2，6-二氯靛酚、抗坏血酸、偏磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、乙二胺四乙酸(EDTA)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、盐酸羟胺、对氨基苯磺酸、α-萘胺、过氧化氢(H，O，)、福林酚、牛血清蛋白 分析纯；H，0，、SOD测试盒 南京建成生物工程研究所。 FA2004C分析天平 上海越平科学仪器有限公司；SHZ-B水浴恒温振荡器 上海博远实业有限公司医疗设备厂；H2050R 高速冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；UV1800紫外分光光度计 日本岛津公司；FE30 电导率仪 梅特勒-托利多(上海)有限公司；Color Flex EZ 色差仪 美国Hunterlab 公司；TMS-Pro 质构仪 美国Food Technology Corporation(FTC)公司；本实验室定制的高压二氧化碳装置。 1.2 实验方法 1.2.1 样品的处理 常温(20±1)℃条件下，将双孢蘑菇放入高压二氧化碳装置的反应釜内，抽真空后分别在0.3 MPa 二氧化碳条件下处理3 min，恢复常压后取出，放置于塑料筐内并用保鲜膜覆盖后在(4±1)℃下贮藏，以未处理的双孢蘑菇为对照。每2d随机取样测定贮藏期间颜色、相对电导率、脂质过氧化、0，·生成速率、H，0、总酚和抗坏血酸含量以及SOD、CAT等酶活性的变化。 1.2.2 褐变度测定 Hunterlab ColorFlex EZ 色差仪用标准白板(L’=94.11；a’=-1.08；b*=2.13)校正，测定双孢蘑菇盖的 CIE-Lab 表色系中L值(从0~100变化，0是黑色，100是白色)，表示样品褐变度，L值越大，表示样品颜色越白。每个处理测定12个整菇，结果取平均值。 1.2.3 细胞膜透性测定 采用相对电导率评价双孢蘑菇的细胞膜透性，相对电导率的测定参照 Liu 等s的方法。用打孔器将双孢蘑菇切成直径为15 mm、厚度为2 mm 的圆片，取取1.0g切好的圆片放入一定体积去离子水中浸泡1h(25±1℃)，用电导率仪测定活组织提取液的电导率，然后将含有样品组织的 浸泡液煮沸30 min 并用去离子水补足体积后，测定总电导率。活组织电导率占总电导率的百分比即相对电导率。 1.2.4 脂质过氧化测定 采用MDA 含量评价双孢蘑菇脂质过氧化程度，MDA 含量的测定参定 Liu 和Wang的方法并略作修改。准确称取 1.0 g双孢蘑菇样品加7.0 mL三氯乙酸，冰浴条件下研磨匀浆，12000×g离心20 min (4℃)，取1.0 mL 上清液与5.0 mL 0.67%硫代巴比妥酸(用0.05 mol·LNaOH溶解)混合后在100℃加热20 min，快速冷却后在12000×g离心10 min，分别测定上清液在450、532、600 nm 处的吸光值。MDA的计算公式如下： MDA 含量(umol·g)=[6.45(OD-OD00)-0.56OD4s0]×提取液总体只/样品质量×1000 1.2.5 总酚含量测定 参照 Gonealves等6的方法，修改如下：取双双蘑菇冻干粉1.0 g，加入60%甲醇7 mL，在40℃下振荡(100 r/min)提取2h，15000×g离心10 min。取0.1 mL 上清液加入稀释至1/10的福林酚试剂 4.9 mL，反应8 min 后，加入质量分数为20%的 Na，CO， 1.5 mL，在 760 nm 处测量吸光值，每组样品做3次平行求平均值，以吸光度为纵坐标、以质量分数为横坐标，根据标准曲线(y=0.0171x-0.0057，R’=0.9977，y，为吸光值、x为没食子酸质量分数，单位为mg*mL-)计算样品中总酚的质量分数，样品中总酚的质量分数用没食子酸当量(mg*g)表示。 1.2.6 抗坏血酸含量测定 参照 Vaz 等”的方法，修改如下：取双孢蘑菇冻干粉1.0 g，加入质量分数为1%的偏磷酸7mL，室温下提取45 min，然后在10000×g下离心5 min。取1mL的上清液和9mL浓度为0.5 mg/mL的2，6-二氯靛酚反应30 min 再在515 nm处测量吸光值，每组样品做3次平行求平均值，根据标准曲线(y，=-4.556x，+0.7488，R=0.9999，其中y，为吸光值、x，为抗坏血酸质量分数，单位为mg*mL-)计算样品中抗坏血酸质量分数，结果以mg*g表示。1.2.7 O，•产生速率测定 参照 Yan 等8的方法并略作修改。称取1.0g双双蘑菇样品，加5.0 mL50 mmol·L'pH7.8的磷酸缓冲液(含1.0 mmol·L-EDTA，0.3% Triton X-100和2%PVP)，冰浴条件下研磨匀浆，12000×g离心20 min(4℃)，取 1.0 mL上清液，加入1.0 mL 50 mmol·L-’pH7.8的磷酸缓冲液和1.0 mL 1.0 mmol·L盐酸羟胺溶液，混合均匀，25℃条件下保温1h。取出后加入1.0 mL 17 mmol·L对氨基苯磺酸和1.0 mL7 mmol·L-'α-萘胺，混匀后于25℃条件下保温20 min 进行显色反应，测定530 nm波长下OD 值，以不进行保温1h的测定作为参比对照，根据标准曲线(ys=0.005x，-0.004，R’=0.9998，其中ys为吸光值、x为0·浓度，单位为 umolL-)计算O·产生速率，单位以 nmol·min ·g表示。计算公式如下： 超氧阴离子产生速率(nmol·min·g')=(ODs3+0.004)×提取液总体积×1000/0.005×吸取样品液体积×反应时间×样品质量 1.2.8 H，0，含量测定 采用H，O，测试盒测定。 1.2.9 抗氧化酶活性测定 准确称取1.0g双孢蘑菇样品加5.0 mL 0.1 mol·L’pH7.4的磷酸缓冲液(含0.8 g·L-'PVP和1mmol·L'EDTA)，冰浴条件下研磨匀浆，12000×g离心20 min(4℃)，上清液即为粗酶液。 SOD 活性测定：采用 SOD 测试盒测定。 CAT活性测定：参照 Liu 等s的方法并略作修改。取 2.4 mL 50 mmol·L'pH7.0 磷酸钠缓冲液加0.1mL酶提液于25℃水浴预热2~3 min， 再加入0.5 mL 40 mmol·LH，O，摇匀，立即计时，H，O，的降解表示为240 nm 处吸光度的下降。每30s记录1次，记录5 min。以1 min 内 OD240降低0.01为一个酶活力单位(U)，CAT 活性表示为U·mg蛋白。 蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝染色法。 1.2.10 数据处理 采用 SPSS 17.0和 SigmaPlot12.5软件对数据进行分析处理，所有实验均重复3次。 2结果与讨论2 短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇褐变度的影响 颜色是消费者判断双孢蘑菇是否可接受的重要参数，采后贮藏期间菌盖的褐变现象十分普遍，是导致商品价值下降的重要原因。从图1可以看出，双孢蘑菇的L值随着贮藏时间的延长逐渐下降，对照的L值下降速度较快，贮藏8d后L值从87.34降到77.61；0.3MPa二氧化碳短时处理的双孢蘑菇在贮藏前期L值下降明显，2d后波动不大，且0~4d的L值均低于对照，仅8d后的L值高于对照，其中0.3 MPa二氧化碳短时处理的双孢蘑菇贮藏8d后的L'值比对照组高3.96%，存在显著差异(p<0.05)。从短期护色效果来看，短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇的护色效果并不理想，这可能与短时高压二氧化碳处理破坏了双孢蘑菇的细胞结构有关。研究表明微生物的侵染能够活化双孢蘑菇多酚氧化酶，进而加速酶促褐变的发生，而高压二氧化碳处理能够抑制微生物生长，这可能是处理组双孢蘑菇在贮藏后期的颜色好于对照的原因之一。 图1 短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇色泽的影响 Fig.1 Effect of short-time HPCD treatmenton color of button mushroom during storage 2.2 短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇细胞膜透性和脂质过氧化的影响 相对电导率和MDA 含量是衡量细胞膜透性和 稳定性的两个主要指标。通常认为相对电导率可以间接反映细胞膜的损伤程度，而 MDA 作为脂质过氧化主要产物，其含量的多少可间接反映细胞脂质过氧化的程度。短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇相对电导率和MDA 含量的影响分别如图2和图3所示。从图2中可以看出，随着贮藏时间的延长，对照组双孢蘑菇的相对电导率从22.86%逐渐增大到28.33%；0.3 MPa 二氧化碳短时处理组的双孢蘑菇相对电导率在贮藏期间则变化平稳，且贮藏0~6d均高于对照，这可能与高压对细胞的破坏作用有关，而8d后的相对电导率为26.43，比对照低6.71%。如图3所示，在8d贮藏期内，对照组双孢蘑菇的MDA从最初的0.43 nmol·g增长到2.45 nmol·g，而0.3MPa二氧化碳短时处理组的 MDA含量则从1.01 nmol·g增长到2.01 nmol·g。贮藏前期处理组相对电导率和 MDA 含量均高于对照组，说明高压处理对细胞结构造成了伤害，加速了膜脂过氧化进程，而在贮藏后期处理组的相对电导导和 MDA含量低于对照组，这可能与高压二氧化碳处理抑制了双 孢蘑菇表面微生物数量的增长有关110.20 图2 短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇相对电导率的影响 Fig.2 Effect of short-time HPCD treatmenton relative leakage rate of button mushroom during storage 图3 短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇 MDA 含量的影响 Fig.3 Effect of short-time HPCD treatmenton MDA content of button mushroom during storage 2.3 短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇总酚和抗坏血酸含量的影响 多酚是双孢蘑菇体内主要的抗氧化物质，该类物质具有维护健康、预防癌症和心血管疾病的有益作用。抗坏血酸是双孢蘑菇体内重要的营养成分之一，然而该物质不稳定，易被氧化，是双孢蘑菇褐变的原因之一。本研究表明双孢蘑菇体内的总酚和抗 坏血酸含量在整个贮藏期呈下降趋势(图4和图5)。由图4可知，贮藏初期(2d)0.3 MPa 二氧化碳短时处理组的总酚含量低于对照的含量，随着贮藏时间的延长，0.3 MPa 高压二氧化碳短时处理组的总酚含量逐渐高于对照的含量，尤其是贮藏8d时0.3MPa二氧化碳短时处理组总酚含量比对照高。如前所述，在贮藏前期，0.3MPa二氧化碳短时处理对双孢蘑菇的褐变抑制效果并不明显，而贮藏后期该处理对褐变的抑制效果则逐渐显现，这表明低褐变程度与高总酚含量有关，总酚含量是双孢蘑菇褐变的限制因素21-22。由图5可知，0.3 MPa 二氧化碳处理组可显著降低抗坏血酸含量的损失，贮藏8d后抗坏血酸含量分别为0.28mggFW，比对照组的高18.12%，这说明0.3 MPa二氧化碳处理可以较好的保持双孢蘑菇体内的抗坏血酸含量。 0.6 图4 短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇总酚含量的影响 Fig.4 Effect of short-time HPCD treatmenton total phenolics content of button mushroom during storage 图5 短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇抗坏血酸含量的影响 Fig.5 Effect of short-time HPCD treatment on ascorbic acid content of button mushroom during storage 2.4 短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇活性氧的影响 0·和H，O，等活性氧导致的脂质过氧化对细胞膜具有严重的伤害作用，导致衰老5-6。短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇0，•产生速率和H，O，含量的影响分别如图6和图7所示。从图中可以看出随着贮藏时间的延长，双孢蘑菇0·产生速率和H，0，含量均呈增加趋势，其中0.3MPa 二氧化碳处理组的变化趋势较对照组平缓，贮藏4d内处理组双孢蘑菇07·产生速率和H，O含量均高于对照组，而贮藏6d后处理组又低于对照组，这种影响趋势与短时高压二氧化碳处理对相对电导率和 MDA 含量的影响趋 势基本一致，这说明活性氧的积累与膜透性和脂质过氧化程度的增大密切相关。 1200 图6 短时高压二氧化碳处理 对双孢蘑菇0，·产生速率的影响 Fig6 Effect of short-time HPCD treatment on superoxideproduction rate of button mushroom during storage 图7 短时高压二氧化碳处理 对双孢蘑菇 H，0，含量的影响 Fig.7 Effect of short-time HPCD treatmenton H，0， content of button mushroom during storage 活性氧的过剩是衰老和果实成熟的内在特征。活性氧的积累不仅能启动脂质过氧化，使维持细胞区域化的膜系统受到瓦解或损伤，而且能与膜结合酶的色氨酸残基或巯基反应导致酶失活。该结果同样说明短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇短期的保鲜效果并不理想，但随着贮藏时间的延长，短时高压二氧化碳处理的保鲜效果逐渐显现。Jimenez等报道番茄成熟过程中0·和H0积累程度的增加伴随着膜脂过氧化的加剧。Liu 和Wang研究发现高氧处理能够显著降低双孢蘑菇0·和H，O的积累，可能与高氧对抗氧化系统的保护作用有关。本研究发现由于短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇细胞结构的破坏作用，导致在贮藏前期0·和H，O，的积累较多，加重了活性氧物质对双孢蘑菇的损伤，而在贮藏后期0·和H，O，的积累较对照减少，因此短时高压二氧化碳对双孢蘑菇的短期保鲜效果并不理想，但从长期来看又具有一定的保鲜效果。 2.5 短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇抗氧化酶活性的影响 SOD 能够催化超氧阴离子生成O，和H，O， 而jCAT能够催化H，O，分解成0，和H，O.两种自由基清除酶能够协同作用来防御活性氧或其它过氧化物 自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对有机体的毒害，这些酶活性的变化如图8和图9所示。从图8和图9可以看出，随着贮藏时间的延长，双孢蘑菇 CAT 和 SOD 的活性均呈先升高后下降的趋势， CAT 和 SOD 活性分别在贮藏6d和4d时达到峰值。在贮藏前期，0.3 MPa 二氧化碳短时处理组的CAT 和 SOD 活性均低于对照组，而在贮藏后期两者活性反而高于对照，这与双孢蘑菇0·和H，O，的积累趋势相符。 50 图8 短时高压二氧化碳处理 对双孢蘑菇 CAT 活性变化的影响 Fig.8 Effect of short-time HPCD treatmenton CAT activity change of button mushroom during storage 12 图9 短时高压二氧化碳处理 对双孢蘑菇 SOD 活性变化的影响 Fig.9 Effect of short-time HPCD treatment on SOD activity change of button mushroom during storage 3 结论 由于高压对细胞结构的破坏作用，短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇的短期保鲜效果并不理想。与对照相比，在4d贮藏期内，0.3 MPa 二氧化碳短时处理降低了双孢蘑菇 CAT 和 SOD 活性，促进了 O， ·、H，O，等活性氧物质的积累，进而加速了细胞膜透性和脂质过氧化进程，导致双孢蘑菇的褐变度加重。 随着贮藏时间的延长，逐渐显现出短时高压二氧化碳处理对双孢蘑菇的保鲜效果。在贮藏后期，0.3 MPa 二氧化碳短时处理抑制了双孢蘑菇的褐变，降低了相对电导率和MDA、0心·H，O，等的含量，提高了 CAT 和 SOD 的活性，这可能与高压二氧化碳对双孢蘑菇表面微生物数量的抑制作用有关。 此外，双孢蘑菇体内的总酚和抗坏血酸含量在整个贮藏期呈下降趋势，但是0.3 MPa二氧化碳短时处理能够减少双孢蘑菇体内总酚和抗坏血酸的损 失，进而抑制双孢蘑菇的褐变。 ( 参 考文献 ) ( [ 1 ] B rennan M ， Le Po r t G， 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